[发明专利]一种后融合状态的新冠刺突蛋白的制备方法及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种后融合状态的新冠刺突蛋白的制备方法及应用。本发明基于在前的发明专利(US11020474B1)，通过重组的方法生产具有完整弗林蛋白酶切位点的前融合状态的刺突蛋白。本申请中，通过体外酶切实验显示，前融合状态的刺突蛋白蛋白能够被弗林蛋白酶酶切，产生具有受体结合功能的后融合状态刺突蛋白。本发明证明，天然的前融合状态的和后融合状态的刺突蛋白都能够做为疫苗或筛选原，从而获得各类具有中和病毒入侵的功能抗体。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种后融合状态的新冠刺突蛋白的制备方法及应用。

背景技术

2019年的新冠病毒给全世界带来了巨大的灾难，而且新的变种病毒还在不断出现。新型冠状病毒(SARS-CoV-2或者2019-nCoV，国际病毒分类委员会2020年2月11日命名)是一个大型病毒家族，可引起感冒及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。目前已知，冠状病毒是通过人的血管紧张素转换酶2(ACE2)进入人体细胞的。人感染了新型冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。但是，目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异的治疗方法，预防和治疗新冠病毒方案非常有限。

冠状病毒刺突蛋白是I类病毒融合蛋白。刺突蛋白在进入宿主细胞前，在细胞膜上以一种完整的前融合状态蛋白(Pre-fusion)形式存在，该蛋白含有精氨酸-X-(精氨酸/赖氨酸)-精氨酸基序(R-X-K/R-R)，能被宿主的弗林蛋白酶(FURIN)识别从而酶切成两个亚基S1、S2，即后融合状态蛋白(Post-fusion)形式存在。前融合状态的刺突蛋白(Spike Pre-fusion)可介导病毒与宿主受体血管紧张素转换酶2(ACE2)的结合，与病毒颗粒吸附和膜融合相关，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。

研究发现，新冠病毒颗粒表面的刺突蛋白绝大部分是处于前融合状态的，即完整新冠刺突蛋白形式存在。宿主细胞的弗林蛋白酶(FURIN)通过酶切可以把前融合状态的刺突蛋白转化为序列断开的含有S1、S2两个亚基的后融合状态的刺突蛋白。这种酶切过程是新冠病毒入侵人体细胞和复制所必须的。弗林蛋白酶切位点的突变或缺失能影响病毒的入侵和复制。因此抑制弗林蛋白酶的活性或者用抗体封闭弗林酶切位点，能抑制前融合状态的刺突蛋白转化为后融合状态的刺突蛋白，就有可能抑制新冠病毒入侵人体细胞。

重组的刺突蛋白细胞外区域(Spike extracellular domain,S-ECD)被广泛应用于蛋白结构研究、细胞功能试验、免疫检测试剂、重组蛋白药物、诊断试剂开发、疫苗等众多领域。重组的刺突蛋白的构象和产量在以上的应用中尤为关键。

然而新型冠状病毒的刺突蛋白含有弗林蛋白酶切位点，在宿主细胞重组过程中容易被宿主的弗林蛋白酶不完全切割成前融合状态蛋白和具有S1、S2两个亚基的后融合状态蛋白的混合体。这样就产生三个问题：第一个不能获得高纯度的前融合状态蛋白。第二不能获得后融合状态蛋白。第三两者产量都不高。为了解决这个问题，可以把弗林蛋白酶识别位点的精氨酸/赖氨酸突变成其他氨基酸。但是这样就产生了非天然结构的蛋白。在功能和用途上带来了新的麻烦。突变的弗林蛋白酶识别位点，不能产生相应的中和抗体。突变的蛋白不能做为弗林蛋白酶的底物，不能转化为后融合状态的蛋白。基于前面的发明，我们进一步提供了后融合状态刺突蛋白的制备方法。

因此，前融合状态的刺突蛋白更为重要。并且，前融合状态的新冠刺突蛋白具有病毒天然结构，具有弗林蛋白酶切位点，是非常理想的靶点和免疫原。新冠刺突蛋白，特别是其受体结合结构域RBD是目前疫苗和中和抗体的重要靶点。但是随着新的突变不断地出现在受体结合结构域RBD上，这些疫苗和中和抗体的效果不断降低。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种后融合状态的新冠刺突蛋白的制备方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。