[发明专利]一种流感疫苗TPCK-胰酶残量检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种流感疫苗TPCK‑胰酶残量检测试剂盒。所述试剂盒包括包被TPCK‑胰酶抗体的酶标板和HRP‑TPCK‑胰酶抗体，所述抗体使用TPCK‑胰酶免疫家兔获取抗血清经纯化所得。本发明具有定量、线性范围大、灵敏度高、特异性强、准确度高、重复性好、耐用性好、高通量等优点，可快速对MDCK细胞基质流感疫苗中的TPCK‑胰酶残量进行定量，为流感疫苗生产提供一种质控方法。

技术领域

本发明属于医疗器械技术领域，具体的，涉及一种流感疫苗TPCK-胰酶残量检测试剂盒。

背景技术

流感病毒在世界范围内引起大流行和季节性流行病，接种疫苗仍然是预防流感和降低相关死亡率的主要措施。流感感染常伴有细菌感染，可导致流感相关肺炎，据估计全球每年有5％～15％的人口发生上呼吸道感染，并造成25万～50万死亡病例。目前，大多数季节性流感疫苗是在鸡胚中生产的，基于鸡胚生产的流感疫苗最大的缺陷是在流感大流行时不能立即、迅速、大规模生产所需的疫苗。鸡胚的供应也可能是不确定的，并面临着禽流感在产蛋鸡群中传播的风险。1995年，WHO建议开发替代基于鸡胚的流感病毒培养体系，特别推荐的是基于哺乳动物细胞培养体系。2007年6月，欧洲药品管理局(EMEA)批准了诺华疫苗公司生产的一种由Madin Darby犬肾细胞(MDCK)培养的流感疫苗基于细胞基质的流感疫苗有许多好处：不需要长时间的鸡胚生产系统，更涉及闭路循环生物反应器的生产过程控制，降低微生物污染的风险，避免了鸡胚传代中流感病毒的抗原变化，同时也为对鸡胚过敏人群提供了一个替代选项。

血凝素(hemagglutinin，HA)是流感病毒的主要糖蛋白，HA必须在蛋白酶水解作用下裂解精氨酸而活化为由二硫键连接的HA1和HA2后，才能形成病毒的感染性(HA1是病毒与红细胞、宿主细胞受体唾液酸连接的部位，病毒吸附与感染有关，HA2具有膜融合活性，参与病毒包膜与细胞膜融合并释放核衣壳的过程)。但是流感病毒HA不能被宿主细胞内的蛋白酶裂解，因此在病毒培养时需要添加适量外源性胰蛋白酶，即TPCK-胰酶。

TPCK-胰酶是蛋白质肽段分析重要的工具，能够专一性地切割蛋白质分子中精氨酸和赖氨酸位点。在病毒培养液中加入适量TPCK-胰酶的目的是为了提高流感病毒在MDCK细胞中的复制能力。TPCK-胰酶对各亚型流感病毒的增值均有提高作用，在进行流感病毒细胞培养中，需要加入适量的TPCK-胰酶。TPCK-胰酶虽然有助于基于MDCK细胞基质流感疫苗的生产，但始终为疫苗外来物质(非疫苗有效成分)，其安全性有待进一步研究。目前《中国药典》(2020年版)因为没有MDCK细胞基质的流感疫苗，亦无TPCK胰酶相关规范。长远来看，建立TPCK-胰酶残留量检测方法对MDCK基质流感疫苗的生产以及质量控制具有重要意义。

发明内容

本发明首先涉及一种检测流感疫苗中TPCK-胰酶残量的检测试剂，所述的检测试剂为多克隆抗体，所述的流感疫苗为采用MDCK细胞基质生产的流感疫苗；

所述的多克隆抗体的制备方法为：由TPCK胰酶免疫家兔后获取的抗血清，再经Protein A/G亲和层析法纯化；

(1)所述的TPCK胰酶为采用MDCK细胞基质生产流感疫苗时使用的胰酶；

(2)所述的免疫家兔后获取的抗血清的步骤为：

初次免疫使用300μg TPCK-胰酶并按体积1：1加入弗氏完全佐剂充分乳化后，背部皮下多点免疫；

然后每间隔1周，使用400μg TPCK-胰酶，并按体积1：1加入弗氏不完全佐剂充分乳化后，背部皮下多点免疫，免疫4次；

最后一次免疫后10天颈动脉采血，将获取的兔全血在37℃环境放置2h后，25℃2500rpm离心15min，吸取上层血清；

(3)所述的Protein A/G亲和层析法的步骤为：

选择血清效价最高的抗血清(效价为64000)，滤纸过滤去除脂质；