[发明专利]一种基于CRISPR技术检测甘薯病毒病的方法

说明书

本发明提供了一种基于CRISPR技术检测甘薯病毒病的方法，具体地，提供了一种基于CRISPR技术检测甘薯褪绿矮化病毒或甘薯病毒病的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明通过对gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，涉及一种基于CRISPR技术检测甘薯病毒病的方法，尤其涉及基于CRISPR技术检测甘薯褪绿矮化病毒的方法、系统和试剂盒。

背景技术

甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)属于长线形病毒科毛形病毒属成员。甘薯褪绿矮化病毒是危害甘薯的主要病毒之一，主要由烟粉虱传播，特别重要的是，甘薯褪绿矮化病毒可与甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染甘薯引起甘薯病毒病(sweet potato virus disease，SPVD)。甘薯病毒病是甘薯上是最严重的病毒病害之一，通常可使甘薯减产50％-98％，甚至绝收。

甘薯褪绿矮化病毒的检测方法主要有：目测法、指示植物检测法、酶联免疫吸附法、免疫电镜法、核酸杂交法、RT-PCR法。

本发明提供了一种新型的检测甘薯褪绿矮化病毒的方法，该方法是基于CRISPR技术，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一种特异性高、检测灵敏度高的快速检测方法。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行甘薯褪绿矮化病毒检测的方法、系统和试剂盒。

一方面，本发明提供了一种用于检测甘薯褪绿矮化病毒的gRNA，所述gRNA包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于甘薯褪绿矮化病毒的核酸。

本发明中，所述与CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域又称为同向重复序列、骨架区或spacer序列，该区域与Cas蛋白相互作用，从而结合Cas蛋白。

在一个实施方式中，所述gRNA自5’端至3’端依次包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有17-30个碱基，并且与SEQID No.2所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.8-9任一所示的序列；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.8、9任一所示的序列。

在优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有17-30个碱基，例如，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.8-9任一所示的序列，并且在SEQ ID No.8-9任一所示的序列的3’端还包括1-13个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.2所示的序列或其反向互补序列杂交；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.8、9任一所示的序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.8-9任一所示的序列相比，在SEQ ID No.8-9任一所示的序列的3’端连续缺失1-4个碱基(例如，1、2、3、4个碱基)。

所述与SEQ ID No.2所示的序列或其反向互补序列杂交，是指上述导向序列与SEQID No.2或SEQ ID No.2的反向互补序列的连续的一段可以连续的互补配对。比如，所述与靶核酸杂交的导向序列含有30个碱基，则，导向序列的30个碱基需要与SEQ ID No.2或SEQID No.2的互补序列的连续30个碱基互补配对。

在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.8-9任一所示。