[发明专利]一种耐高温、耐高糖的酿酒酵母菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种耐高温、耐高糖的酿酒酵母菌株及其构建方法和应用，所述酿酒酵母菌株SEB19保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏名称为SEB19，其保藏号为：CGMCC NO.22589，构建方法为：以菌株SEB4为出发菌株，利用CRISPR/Case9基因编辑技术将菌株SEB4的功能基因ASP3敲除获得工程菌株SEB19。本发明所述菌株SEB19能够耐高温、耐高糖，确保纤维素的酶解和微生物发酵可以同步进行，且能够提高乙醇产量。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种耐高温、耐高糖的酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。

背景技术

近年来，随着全球环境的恶化及化石能源的日益枯竭，越来越多的国家开始关注可再生清洁能源燃料乙醇的开发和利用。燃料乙醇的生产通常采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行发酵，酿酒酵母最适生长温度为30-32℃。然而，在工业生产中，同步糖化发酵(SSF)过程存在一个重要问题，即最佳酶解温度(45-50℃)和最佳微生物乙醇发酵温度(25-35℃)存在较大差异，导致纤维素的酶解和微生物发酵过程难以同步进行。同时，在工业生产中随着菌株的代谢和机械搅拌等常导致发酵体系温度升高(时常可达35-37℃)。高温会引起酵母细胞内各种成分的理化性质发生变化，从而影响细胞正常的生命活动。为了减少冷却水的使用和染菌的风险，选育耐高温酿酒酵母可实现在较为宽泛的控温前提下保证燃料乙醇生产的稳定性，减少冷却成本。此外，在超高浓度(VHG)发酵过程中，需要酵母能够耐受高糖胁迫从而提高乙醇产量。

因此，构建耐高温、耐高糖的酿酒酵母很有必要，具有一定经济价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐高温、耐高糖的酿酒酵母菌株，该菌株能够耐高温、耐高糖，确保纤维素的酶解和微生物发酵可以同步进行，且能够提高乙醇产量。

此外，本发明还提供一种耐高温、耐高糖的酿酒酵母菌株的构建方法和应用。

本发明通过下述技术方案实现：

一种耐高温、耐高糖的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏名称为SEB19，其保藏号为：CGMCC NO.22589，分类命名为Saccharomyces cerevisiae,保藏日期为2021年5月24日，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

本发明所述菌株SEB19具有多重耐受性，能够耐高温、耐高糖，确保纤维素的酶解和微生物发酵可以同步进行，且能够提高乙醇产量，能够适用于多种环境胁迫下物料发酵。

一种耐高温、耐高糖的酿酒酵母菌株的构建方法，以具有良好耐受性的工业酿酒菌株SEB4为出发菌株，利用CRISPR/Case9基因编辑技术将功能基因ASP3敲除获得工程菌株SEB19。

本发明前期基于转录组学的研究发现在高温、高温乙醇双胁迫和高糖等多种胁迫条件下，工业酿酒酵母菌株SEB4中基因ASP3(编码L-天冬酰胺酶II)均显著下调。目前，仅有研究表明在酵母细胞氮饥饿期间会诱导ASP3的表达，而该基因与细胞表型之间的关系并未得到证实。本发明首次发现，敲除该基因可以显著提高酵母的高温、高温乙醇和高糖等耐受性。

具体地：

出发菌株：

出发菌株SEB4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11324。

培养基：

所用培养基如表1所示。若培养基为固体培养基，则在灭菌前加入2.0％的琼脂粉。灭菌条件为121℃，15min。所有的抗生素均在培养基灭菌后，待冷却至50～60℃后添加。

表1培养基组成