[发明专利]靶向小鼠Ube3a基因的gRNA及构建AS疾病小鼠模型的方法

说明书

本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA及构建AS疾病小鼠模型的方法；本发明设计了特异性靶向Ube3a基因的2条gRNA，利用cas9蛋白将Ube3a基因的Exon6敲除，所敲区域序列为非3倍数，造成移码突变，且敲除区域包含该基因编码区的47.7%，从而达到将该基因敲除的目的，使用CRISPR/Cas9系统构建Ube3a基因敲除小鼠模型方法简单易行，周期短，拿到阳性小鼠的概率高，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并为进一步开发针对该疾病的治疗方式提供服务。

技术领域

本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA及构建AS疾病小鼠模型的方法。

背景技术

Angelman综合征(AS)又称天使综合征又被称之为快乐木偶综合征，是一种罕见的神经发育性遗传疾病，全球发病率约为1/15000。2018年，AS被收录于我国的《第一批罕见病目录》中。该症会导致发育障碍、神经系统障碍，有时还会导致癫痫。患者的预期寿命虽然跟常人一样，但不能治愈，目前主要的治疗手段包括使用抗癫痫药物、控制癫痫发作，对于孩子的运动和语言发育迟缓进行康复训练，这些天使综合征的患者通常无法生活自理，需要终生被照顾。

AS发病机制是由于来自母亲的第15号染色体的印迹基因Ube3a功能缺失导致的。Ube3a基因编码E3泛素蛋白连接酶，是泛素蛋白降解系统的一部分，该基因在1997年被发现与AS有关。目前已明确4种遗传机制可以导致AS，包括基因缺失、UBE3A突变、印迹中心缺陷和父源15号染色体存在单亲二体。其中缺失情况最常见，发生在母亲的Ube3a拷贝缺失，涉及染色体15q11.2-q13，占 AS病例的70％左右。其次是Ube3a突变，占病例的11％，突变导致基因表达受影响。第三是从母亲遗传的第15条染色体的印迹中心缺陷，导致基因功能异常，约占病例的6％。此外，父源15号染色体存在单亲二体(UPD)，病例有两个15 号染色体均来自父亲，由于来自父亲的UBE3A沉默或关闭，母亲的Ube3a缺失，大脑无法从Ube3a获得所需的信息，导致疾病发生。目前，虽然Ube3a基因突变对于AS的致病作用已经明确，但具体的分子机制尚需深入研究。所以，为了研究该疾病的发病机制以及开发有效的治疗方法，构建该疾病的实验模型对于疾病的研究不可或缺。目前小鼠模型是目前公认到的制备人类疾病模型及研究基因组功能最有效的疾病模型。但是还缺乏高效的建立AS疾病小鼠模型的方法。

发明内容

针对现有技术不足，本发明利用CRISPR/Cas9技术快速在小鼠体内将Ube3a 基因敲除，构建AS疾病模型。CRISPR/Cas9是一种由gRNA指导，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术，其工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物会引导Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA，通过人工设计crRNA和tracrRNA两种RNA，改造成具有引导作用的gRNA，从而引导Cas9蛋白对DNA的定点切割，并产生一个平末端的双链DNA缺口，进而启动DNA损伤修复机制，主要通过非同源末端连接(Non-homologous endjoining， NHEJ)或同源重组(Homologous recombination，HR)的方式将断裂上下游两端的序列连接起来。Cas9蛋白若要发挥作用需要靶位点下游的一个5’-NGG-3’基序，即PAM序列，基因特异的gRNA模板序列为位于PAM序列前，同时gRNA序列避免4个以上的T结尾，GC含量最佳为30％～70％。另外在选择gRNA时应考虑到其脱靶效应，全基因的脱靶效应需考虑脱靶位点的碱基错配数尽量不超过5个。基于以上考虑，我们共设计了2条针对Ube3a基因的gRNA，分别靶向Exon6的5’端和3’端。

本发明包括以下技术方案：

一组靶向小鼠Ube3a基因的gRNA，其特征在于，包括2条gRNA，其核酸序列分别为：