[发明专利]一种高效分离纯化血浆外泌体的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及生物医药的科研和临床研究领域，尤其涉及一种高效分离纯化外泌体的方法。本发明的目的是提供高质量的分离血浆中的外泌体，并提取外泌体中含有的核酸分子的试剂。

技术领域

本发明涉及生物医药的科研和临床研究领域，尤其涉及一种高效分离纯化外泌体的方法。

背景技术

外泌体（exosome）是一种是一种能被大多数细胞分泌的囊泡家族成员，具有脂质双层膜结构，直径在30-150nm之间，不同的组织或者细胞分泌的外泌体数量以及外泌体内部含有的RNA分子数量差别较大。多种体液中都存在大量的外泌体，如血液、体内积液、尿液、乳汁等含量都比较丰富。外泌体可以通过血液进行体内循环，并将其内部携带的核酸分子转移到不同的组织和细胞中，因此外泌体及其内含物核酸的相关研究具有非常重要的意义。但是目前血浆外泌体分离技术不够成熟，外泌体分离纯度不够高，使得基础和临床研究都难以非常顺利的进行，因此迫切需要一种高效和高纯度的分离纯化外泌体的方法。目前分离外泌体的方法主要是通过超速离心、差速离心、梯度离心等方式，但是这些方式对于样本量、仪器等要求都比较高，因此常规实验室很难顺利完成，并且会导致外泌体的纯度、数量、完整程度等都受到影响。

发明内容

本发明的目的是提供高质量的分离血浆中的外泌体，并提取外泌体中含有的核酸分子的试剂。

本发明提供的试剂，是亲水聚合物，盐离子溶液以及糖原。

上述试剂中，所述亲水聚合物为聚乙二醇（PEG），分子量为6000道尔顿。

上述试剂中，所述盐离子溶液的溶剂为灭菌后的水，溶质为无机盐氯化钠（NaCl）。

上述试剂中，所述糖原为商品化糖原，浓度为20mg/ml。

上述试剂中，所述亲水聚合物、盐离子溶液以及糖原混合，混合方法为聚乙二醇16g和氯化钠5.84g、糖原50mg以及100mL纯水。

上述试剂中，所述亲水聚合物浓度为160mg/mL，体积为100mL。

上述试剂中，所述盐离子溶液浓度为58.4mg/mL，体积为100mL。

上述试剂中，所述糖原终浓度为0.5mg/mL。

上述试剂中，混合溶液使用0.44μm滤膜进行过滤，制备成储存液，储存液命名为ExoBY。

本发明的另一个目的是提供一种分离血浆中外泌体的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述试剂，或上述试剂配方的应用，均在本发明的范围。

在所述方法中，对分离得到的外泌体进行进一步的检测和核酸提取检测

上述方法具体如下：

将待测样本、上述储存液等体积混匀，得到混合液，使混合液中聚乙二醇在混合液中的浓度为80mg/ml，将所述混合液在静置，收集沉淀，即得到外泌体。

上述静置条件温度为4℃，时间为12小时以上。

本发明的相关实验证明，本发明利用亲水聚合物聚乙二醇（PEG）与盐离子配合使用可以提高外泌体分离的效率。本发明提供了一种分离外泌体的试剂盒，能够改变外泌体在血浆液体中的微环境，有利于外泌体在上述环境中沉降富集；获得的外泌体纯度较高，结构较万整，适合进行外泌体下一步的检测和内含物的测序和分析。本发明所分离出来的外泌体，可以用常规的核酸提取方法如TRizol、miRNA提取试剂盒等进行核酸提取。

附图说明

图1到图4为本发明的试剂盒分离血浆外泌体进行电镜检测的结果。

图5到图8为本发明的试剂盒分离血浆外泌体进行粒径范围检测的结果。