[发明专利]一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法与应用

说明书

本发明提供一种利用人鼻拭子无创取样培养鼻粘膜类器官的方法与应用，该培养鼻粘膜类器官的方法是通过鼻拭子采样后收集其中的鼻粘膜上皮细胞，将获得的鼻粘膜上皮细胞转移至基质胶混合病进行培养获取鼻粘膜类器官。本发明提供一种鼻粘膜类器官样本库的建立方法，包括：采用上述方法获得鼻粘膜类器官；将鼻粘膜类器官进行传代培养；将传代培养的鼻粘膜类器官进行冻存建库。本发明首次利用人鼻拭子无创取样成功培养得到鼻粘膜类器官，整个制备过程简单易行，成本低，具有良好的推广应用价值。并且方法的工艺操作中鼻粘膜类器官快速生长，并可长期稳定培养，形成的鼻粘膜类器官形态为空腔状，能在体外很好地保留上皮细胞的组织特征。

技术领域

本发明涉及类器官培养技术领域，具体涉及一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法与应用。

背景技术

病毒侵入人体的方式，感染的机制、有效检测方法、抗病毒药物、中和抗体的反应和疫苗的开发，都急需一种接近人体组织和微环境的疾病模型。根据《新型冠状病毒肺炎防控方案(第六版)》规定，每个新型冠状病毒肺炎疑似病例和聚集性病例，必须采集急性期呼吸道标本进行核酸检测。

鼻腔是呼吸道病毒侵入人体的第一站，病毒感染早期，鼻粘膜病毒载量往往远高于口咽和下呼吸道。Meinhardt等发现嗅粘膜是鼻腔内新冠载量最高的部位，病毒直接损伤持细胞和基底细胞造成感染者嗅觉障碍。Hernes H对流感病毒的取样检测做了鼻拭子和咽拭子的对比，32名流感病毒病患取样检测的对比结果表明，鼻拭子取样样本的检出率比咽拭子的高54倍。这说明鼻粘膜也是新冠病毒直接损伤的第一个靶器官。鼻粘膜类器官含有纤毛细胞、分泌细胞和基底细胞等多种细胞成分，不但具备典型的假复层柱状纤毛上皮的组织学特征，能形成具有分泌功能的腺腔结构，还能观察到节律摆动的纤毛和粘液毯共同组成的粘液纤毛传输系统。更重要的是鼻粘膜类器官的纤毛细胞和杯状细胞ACE2和TMPRSS2均表达较高，新冠病毒感染实验获得成功，是研究新冠病毒变异、感染和传播、免疫机制和抗病毒药物、疫苗开发的理想模型。但正常人类鼻粘膜，仅在鼻腔结构畸形，如泡状中鼻甲等手术时能够少量获取，来源严重受限，且存在伦理风险。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种鼻咽拭子取材培养鼻粘膜类器官的方法与应用。本发明的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种利用人鼻拭子无创取样培养鼻粘膜类器官的方法，是通过鼻拭子采样后收集其中的鼻粘膜上皮细胞，将获得的鼻粘膜上皮细胞转移至基质胶混合均匀，然后加入鼻粘膜类器官培养基进行培养，获取鼻粘膜类器官。

进一步地，所述方法具体包括：

步骤1，将鼻拭子插入受检者鼻腔取样，然后将已采样鼻拭子放入组织保存液中在一定温度下保存；

步骤2，将保存的已采样鼻拭子上的组织收集，加入DTT溶液混匀后于37℃下恒温震荡，再经100μm滤网过滤得到细胞滤液，离心后保留细胞沉淀；

步骤3，在细胞沉淀中加入BEGM培养液重悬细胞，于37 ℃孵育，之后采用差速贴壁法除去先贴壁的成纤维细胞后，收集鼻粘膜上皮细胞；

步骤4，采用适量的Advanced DMEM/F12培养基重悬鼻粘膜上皮细胞，加入基质胶混匀后将胶滴接种至培养皿，待胶滴凝固后于37℃恒温倒置一段时间，加入鼻粘膜类器官培养基于37℃、5%CO₂条件下培养6-12天，每间隔2-3天更换一次培养基。

优选地，所述鼻拭子为尼龙植绒鼻拭子。

可选地，所述组织保存液按照终浓度的组成为：5-10%（wt/wt）FBS，1000U/ml青链霉素，50-100μg/ml庆大霉素，2-3μg/ml二性霉素B，溶剂为DMEM培养基。

进一步地，所述BEGM培养液中还含有50-200IU／ml青霉素和50-200IU／ml链霉素。

进一步地，所述基质胶在胶滴中的终浓度为5-8mg/ml。