[发明专利]蟾酥中11种蟾毒配基类成分的HPLC指纹图谱建立方法及应用

说明书

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及蟾酥中11种蟾毒配基类成分的HPLC指纹图谱建立方法及应用，本发明首先通过优化色谱条件，在现有研究最多同时测定蟾酥中8种蟾毒配基类成分的基础上，建立了11种蟾毒配基类成分的指纹图谱检测方法，此方法仪器成本低，操作简单，重复性好，灵敏度和分离效率高，检测效率高，可以作为蟾酥质量监测和品质评价的可靠手段。本发明还进一步将指纹图谱方法应用于多批次蟾酥质量检测中，并运用相似性分析、主成分分析和聚类分析，使得蟾酥内在质量得到更为全面有效的评价，为蟾酥的基础研究和临床运用提供依据和参考。

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及蟾酥中11种蟾毒配基类成分的HPLC指纹图谱建立方法及应用。

背景技术

在中国，蟾蜍已有上千年的药用历史，关于蟾蜍的古籍记载可以追溯到唐代《药性论》。中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)和黑眶蟾蜍(Bufo melanostictusSchneider)作为我国最为重要的两种蟾蜍，其包含多种药用部位，如蟾酥、蟾皮、蟾衣等。目前，蟾酥已成为国家重点保护的II级野生药材，在《部颁标准》和《中华人民共和国药典》2020年版88个成方制剂(329个批号)中均含有蟾酥。

蟾酥(Bufonis venenum)是蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥加工品，具有解毒、止痛、开窍醒神等功效。现代药理学研究表明，蟾酥中的活性成分，如蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基等在抗肿瘤、强心、镇痛、抗炎、免疫调节等方面疗效显著。《中华人民共和国药典》(2020年版)以蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基三种蟾毒配基类成分作为蟾酥质量控制的指标成分。这类化合物C17位侧链连有一个六元不饱和内酯环(α-吡喃环)，是此类化合物发挥生理活性的关键基团。但根据文献报道，现有研究运用HPLC法最多同时测定了蟾酥中8种蟾毒配基类成分。但蟾酥作为我国传统名贵中药，已分离鉴定出上百种化学成分，目前尚无超过8种成分的多成分同时定量的报道。

由于中药成分复杂，通过单一成分进行质量检测不仅耗时耗力，而且难以充分反映中药材内在质量。中药指纹图谱作为一种综合的、可量化的鉴定手段，能够较为全面地反映中药中所含化学成分的种类与数量，从而实现对中药质量的整体描述和评价，已成为目前中药质量控制的有效手段之一。自2006年开始，中药指纹图谱被用于蟾酥药材的成分研究，从基原、产地和制剂等方面建立研究方法用以评价蟾酥质量。然而，这些研究缺乏多指标成分多分析手段系统性评价，且所建立的指纹图谱包含的活性成分数量较少。

发明内容

针对上述问题，本发明提出了蟾酥中11种蟾毒配基类成分的HPLC指纹图谱建立方法及应用。本发明建立了11种蟾毒配基类成分的HPLC指纹图谱，并结合含量测定、相似度分析、主成分分析和聚类分析对12批次蟾酥质量进行全面评价。

本发明所述的蟾酥中11种蟾毒配基类成分的HPLC指纹图谱建立方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

精密称取伪异沙蟾毒精、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾蜍它里定、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、脂蟾毒精、南美蟾毒精、蟾毒灵、脂蟾毒配基和华蟾酥毒基对照品粉末适量，分别加入甲醇并溶解，配制为对照品溶液。精密吸取11种对照品溶液各0.5mL，置于10mL容量瓶，加入甲醇定容，配制为混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备

精密称取0.1g蟾酥粉末，置于15mL的离心管，加入甲醇10mL。称重后超声提取1h。超声结束，溶液静置至室温，甲醇补足失重。离心后取续滤液过0.22μm的滤膜，最终得供试品溶液；

(3)采用HPLC分别测定步骤(1)的对照品溶液和步骤(2)的供试品溶液，并分别得到所述供试品溶液和所述对照品溶液的液相色谱；

(4)将步骤(3)得到的液相色谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到11种蟾毒配基类成分的HPLC指纹图谱。