[发明专利]人诱导多能干细胞诱导分化神经细胞评价模型的构建及其评价药物神经毒性的用途

权利要求书

1.一种用于评价候选化合物神经毒性的方法，其特征在于，所述方法由以下两种组成：

(1)在候选化合物存在时培养神经元，并确定所述候选化合物对于神经突生长毒性的影响；以及

(2)在所述候选化合物存在时培养神经元，并监测所述神经元电生理活动的情况；

其中，在培养所述神经元的过程中，不添加血清，

其中，所述神经元来源于人神经干细胞的定向分化，所述人神经干细胞定向分化第21天转变成所述神经元，

其中，所述神经干细胞的接种浓度为1×10⁸L^-1，

其中，将所述神经元转移至微电极阵列板，培养60天直至产生稳定连续的放电后，分别加入不同浓度的所述候选化合物，分别检测给药24h、48h和72h后的所述神经元电生理活动的情况，

其中，所述人神经干细胞为人类诱导多能干细胞诱导的神经干细胞，所述人类诱导多能干细胞来源于女性皮肤成纤维细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选化合物选自以下的一种或多种：奥沙利铂、苯妥英钠、大黄素、乌头碱、异烟肼、乙胺丁醇、金刚烷胺、丙烯酰胺和氧化铁纳米粒子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：在所述候选化合物不存在时培养所述神经元，并与所述候选化合物存在时的所述情况相比较。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人神经干细胞为商业化的人神经干细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：添加神经干细胞维持培养基、神经元定向分化维持培养基和神经元接种培养基，将所述人神经干细胞定向分化成所述神经元。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述人神经干细胞的定向分化成所述神经元的过程中，分别于所述神经干细胞定向分化第7、14、21天，使用β-微管蛋白Ⅲ和微管相关蛋白2免疫荧光标记所述神经元。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述人神经干细胞的定向分化成所述神经元的过程中，分别于所述神经干细胞定向分化第0、7、14、21天检测以下基因的表达情况：微管蛋白、突触素、胶质纤维酸性蛋白、波形纤维蛋白、谷氨酸转运体和巢蛋白。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用所述微电极阵列技术监测所述神经元平均放电率和簇频率均值变化的情况。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用高内涵细胞成像系统检测所述神经突生长的情况。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用高内涵细胞成像方法确定所述候选化合物对于所述神经突生长毒性的影响。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在所述高内涵细胞成像方法中，绿色荧光标记所述神经元和所述神经突，蓝色荧光标记细胞核。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经突生长毒性的评价指标选自以下的一种或多种：神经突总长度、最长神经轴突数、神经突端点数、神经段数、神经根数和神经节点数。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，向所述神经元分别添加4个剂量水平的所述候选化合物，检测所述候选化合物影响所述神经突生长的所述评价指标的剂量效应关系。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法在评价药物神经毒性中的用途。