[发明专利]一种广谱型的新城疫病毒全基因组扩增引物和扩增方法

说明书

本发明属于NDV的疫苗开发和以重组NDV为基础的其他生物制品制剂技术领域，具体涉及一种广谱型的新城疫病毒全基因组扩增引物和扩增方法。本发明以新城疫病毒的总RNA为模板反转录合成cDNA，通过引物Part 1up/Part1down和Part 2up/Part 2down对cDNA进行RT‑PCR扩增得到Part 1和Part 2基因片段，经连接、转化，挑取阳性克隆得到新城疫病毒全基因组序列。本发明通过独特基因分段扩增方案，大大缩短建立重组NDV反向遗传系统的时间，该方案可用于所有新城疫病毒基因型，所需时间仅为目前已有方案的四分之一，并且保证病毒基因组的准确性和反向遗传系统构建的效率，在新城疫病毒疫苗的研发等方面具有极大的应用前景。

技术领域

本发明属于NDV的疫苗开发和以重组NDV为基础的其他生物制品制剂技术领域，具体涉及一种广谱型的新城疫病毒全基因组扩增引物和扩增方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)，又称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)感染引起的禽的一种急性高度接触性传染病。新城疫病毒毒株众多，根据其毒力的不同，新城疫病毒可分为强毒株，中等毒力毒株和弱毒株。其中，强毒株NDV感染鸡只后，常常造成的毁灭性疾病，死亡率可高达90％以上，因此ND被世界动物卫生组织定为必须上报的疾病之一。

NDV属于副黏病毒科，禽副黏病毒属的成员。NDV虽然只有一个血清型，但基因型众多，并且随着病毒的不断进化，还有可能出现新的基因型。自从1999年第一株重组新城疫病毒被成功拯救出以来，目前全世界已有十余种不同毒株的新城疫病毒的反向遗传系统被建立。在建立新城疫反向遗传平台的过程中，完整无误的获得NDV的全基因组是公认的难点之一。其原因在于：一，基因组大。NDV是一种负链RNA病毒，其基因组大小约15kb。负链RNA病毒不能直接通过感染性RNA来拯救，只能通过克隆全部的基因组序列构建质粒，并同时表达N蛋白，P蛋白，和L蛋白，形成RNA聚合酶复合物来实现病毒的拯救。二，NDV病毒复制特征独特，NDV病毒复制基因组具有一个独特的规则，被称为“6原则”(Rule of Six)，即新城疫病毒的基因组必须为6的倍数的时候，NDV才能被拯救成功，这一特征要求在构建NDV全长的时候，任何一个碱基的缺失或插入都可以导致病毒拯救的失败。

发明内容

鉴于目前新城疫反向遗传学方法的缺点，本发明提供了一种广谱型的新城疫病毒全基因组扩增引物和扩增方法。

本发明采用如下技术方案：

一种广谱型的新城疫病毒全基因组扩增引物，包括以下引物：

Part 1up：5′-ACCAAACAGAGAWTCBGTGAG-3′；

Part 1down：5′-AAGAATACCCTCCCTGTTGC-3′；

Part 2Up：5′-GCAACAGGGAGRGTATTCTTYTC-3′；

Part 2Down：5′-ACCAAACARAGATTTGGTGAATG-3′；

V1 up：5′-AGGGAGRGTATTCTTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCC-3′；

V1 down：5′-GASTCTCTGTTTGGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGCG-3′；

V2 down：5′-AAATCTYTGTTTGGTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCC-3′。

利用所述引物快速扩增新城疫病毒全基因组的方法，包括以下步骤：

S1、提取新城疫病毒的总RNA，以所述总RNA为模板，反转录合成cDNA；