[发明专利]转氨酶突变体及其应用

说明书

本发明提供了一种转氨酶突变体及其应用。其中，转氨酶突变体在SEQ ID NO：1所示序列基础上发生氨基酸突变，氨基酸突变为W60Y、Y168A、V379W、V379L、V379M、C418Q及C418W的单点突变或组合突变，这些转氨酶突变体的活性、稳定性、对温度、pH及有机溶剂耐受性提高，解决了现有技术中转氨酶在极端环境中的耐受性差的问题，适用于酶工程领域。

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。

背景技术

手性胺是合成许多手性药物的重要中间体，也是含氨基的光学纯药物的主要成分。神经类药物、血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等都是以手性胺作为中间体。转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺。但游离酶酶促方法在放大生产应用中存在很多问题，如酶活性低及酶用量大导致发酵成本增加；易受反应体系中有机溶剂的影响而变性失活，后处理回收产物是乳化现象严重，三废产生量大等。另外，在分离产品胺的过程中，只能通过使酶变性失活形成沉淀后除去并丢弃，无法再利用。

固定化酶的研究始于1910年，正式研究于20世纪60年代，70年代已在全世界普遍开展。酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃，得到迅速发展和广泛的应用。因此，固定化酶已经成为近代酶工程领域中主要的研究内容之一。固定化酶较高的稳定性，使其在工业生产中有广阔的前景。

使用固定化酶进行批次搅拌反应，可以实现酶的重复使用，同时可以极大地缓解后处理乳化现象并减少三废的产生。但批次搅拌反应需要进行固定化酶的回收操作，间歇性的投料会影响产能，搅拌产生的剪切力容易使酶失活，且搅拌动力消耗较大。固定化酶连续流酶促反应是将固定化酶填充至管道式反应器中，采用泵将底物以适当的流速从反应器入口注入，出口处接收产品。连续流反应设备简单，能耗低，节省人力，产能高，更适合于固定化酶的放大应用。

由于现有的底物酮(氨基受体)大多都水溶性不好，无法在纯水相中进行连续化反应。若要实现连续化反应，则需要较高的温度，或加入足够的有机助溶剂使底物溶解，但极端的温度、pH及有机溶剂等极易使转氨酶失活。因此需要对转氨酶进行改进，以改善其在高温、有机溶剂等极端环境中稳定性差而应用受限的问题。

前期，我们对转氨酶进行改造，得到能耐受45℃高温，50％高浓度有机溶剂的突变体(CN 108384767B)，并通过无载体固定化(CLEA)，氨基载体共价固定化等技术实现对转氨酶突变体的成功固定化，重复使用次数可达18次。为了实现填充床反应器的连续反应，使用高浓度助溶剂，即≥35％(v/v)甲醇溶液使底物完全溶解。在此高浓度有机溶剂条件下，载体固定化酶成功实现转氨酶酶促反应的连续化，保留时间600min，连续运行240h，转化率无降低。但600min的保留时间在工业应用中效率仍较低。为了提高生产力，固定化酶的活性和稳定性需进一步提高。蛋白工程技术可以在分子结构角度对酶分子进行定向改造而得到性能提高(如活性、耐受性、底物谱等的提高)的突变体。酶的固定化技术通常能提高酶的存放、使用稳定性，及对温度、pH、有机溶剂等的耐受性。最重要的是，固定化后的酶可以回收重复使用，减少酶的浪费。通常情况下，酶经固定化后，尤其是共价结合方式的固定化，酶活会降低，即酶活回收100％，为了提高固定化酶的酶活回收，最直接有效的方法是先将游离酶进行定向改造，提高酶对较极端条件的耐受性，降低酶在共价固定化过程中的活性损失，并能进一步提高固定化酶的使用寿命。