[发明专利]一种用于制备手性醇化合物的羰基还原酶突变体及其用途

说明书

本发明涉及一种羰基还原酶突变体及其用途，所述羰基还原酶突变体是在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列存在下述突变之一或者两种以上的组合：45位的V突变为I(V45I)，63位的K突变为Q(K63Q)，141位的G突变为A(G141A)，141位的G突变为V(G141V)，195位的I突变为L(I195L)，204位的A突变为V(A204V)。本发明羰基还原酶突变体用于手性醇合成时，底物浓度可达100g/L以上，并且有高达99.5％的的立体选择性，酶活性高，催化效率好。本发明方法与化学合成法相比，显著减少或消除了各类污染性化学品的使用，从而显著降低了环境污染风险。选择了特定的羰基还原酶突变体，酶活性高，立体选择性好，极大地提高生产效率，降低生产成本，适合大规模的工业生产。

技术领域

本发明属于酶工程和有机合成领域，尤其涉及一种用于制备手性醇化合物的羰基还原酶突变体及其用途。

背景技术

手性双醇类化合物是靶向肝脏药物所使用的关键中间体，已在多个临床及临床前研究药物中使用。例如甲磺酸帕拉德福韦，该肝靶向前药目前由西安新通医药股份有限公司开发，已完成临床二期，目前正在开展临床三期。该关键双醇中间体均采用化学的合成路线。

在专利文献US20030225277中报道了制备方法，工艺路线如下：

该技术方案需要使用有机催化剂(+)-DIPCl，该催化剂价格昂贵，工艺操作繁琐，难以应用于规模化生产。使用该工艺路线制备的双醇化合物的手性纯度为98％，为了满足注册申报要求，需要对其手性纯度进行精制，进一步增加了生产成本，整体路线生产成本较高，因此迫切需要一条满足商业生产的制备方法。

现有技术中有很多使用羰基还原酶及其突变体对羰基进行还原的文献。羰基还原酶可以实现羰基的高立体选择性，在制备手性醇方面具有广泛的应用。需要解决的问题主要是高的酶活力和立体选择性。

CN112941043公开了一种羰基还原酶及其突变体，可以用于制备手性β’羟基-β-氨基酸；CN112626144A公开了一种用于制备替诺福韦中间体的生物合成方法，使用了羰基还原酶；CN112359028A公开了一种羰基还原酶，是产酶菌株Escherichia coli TM1908接种，发酵得到。

CN102482648A公开了一种制备α-氯代醇的立体选择性好的酮还原酶。其转化率和立体选择性都高，但是酶活力不足，还不能满足实际需求。特别是工业化大规模制备。

CN108753851A公开了一种以羰基还原酶为生物催化剂制备手性单羟基衍生化的的手性醇的方法，其利用的羰基还原酶为ChKRED12，其在NCBI数据库中的登录号为KC342012。

但是利用现有技术中已知的羰基还原酶在还原特定结构的底物时，还存在酶活性不足的情况，并不利于开展大规模的工业化制备。由于的酶的价格都比较昂贵，酶活性严重制约着是否能产业化。

发明内容

针对现有技术中的羰基还原酶制备手性双醇化合物，特别是帕拉德福韦中间体(S)-1-(3-卤代苯基)-1,3-丙二醇时，存在酶活性不足的缺陷，本发明提出了一种羰基还原酶突变体，其具有更高的酶活性和优异的立体选择性，为(3-卤代苯基)-1,3-丙二醇类的医药中间体的酶合成提供了产业化的便利。

本发明第一个目的是提供一种羰基还原酶突变体，是在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列存在下述突变之一或者两种以上的组合：45位的V突变为I(V45I)，63位的K突变为Q(K63Q)，141位的G突变为A(G141A)，141位的G突变为V(G141V)，195位的I突变为L(I195L)，204位的A突变为V(A204V)。

进一步地，所述羰基还原酶突变体，是在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列存在下述突变之一：