[发明专利]CAR-T细胞及其制法

权利要求书

1.一种嵌合抗原受体，其特征是，包括：

a)作为第一信号的抗原结合结构域、

b)跨膜结构域、

c)作为第二信号的细胞内传导结构域、以及

d)表达IL-7和CCL-17细胞因子的第三信号域；

该嵌合抗原受体包含序列2所示的氨基酸序列。

2.一种重组质粒，其特征是，其具有如序列1所示的核苷酸序列。

3.一种CAR-T细胞，其特征是，其能够分泌表达IL-7、CCL17因子和/或PD-1、GM-CSF抗体，并且该CAR-T细胞转染了表达权利要求1所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列。

4.制备权利要求3所述CAR-T细胞的方法，其特征是，其包括以下步骤：

(1)质粒合成：

使用载体pLVX-EF1a-IRES-PGK-puro合成CAR-19-1质粒，该质粒具有序列1所示的核苷酸序列，并且该质粒序列是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号、IL-7、CCL17序列构成；

使用载体pLVX-EF1a-IRES-PGK-puro合成CAR-19-2质粒，该质粒具有序列3所示的核苷酸序列，并且该质粒序列是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号序列构成；

使用载体pLVX-mCherry-C1合成CAR-19-3质粒，该质粒具有序列5所示的核苷酸序列，并且该质粒序列是由anti-PD-1scFv单链可变区、anti-GM-CSF scFv单链可变区序列构成；

(2)病毒包装：

使用Invitrogen Lipofectamine 3000转染试剂即Lip3000进行病毒包装，293T培养基为添加10% FBS 的DMEM-H培养基，慢病毒包装培养基为添加1% GlutaMAX、1mM丙酮酸钠、5%FBS的Opti-MEMI培养基；

将293T细胞以7x10⁶个细胞/孔的密度接种于含12 mL的慢病毒包装培养基的10cm培养皿中，置于37℃、5% CO₂条件下孵育细胞过夜至293T细胞密度达95%；

将孵育过夜的培养皿每皿去除6 mL的慢病毒包装培养基，接着向每个皿中加入6mL 的A液-B液混合液，轻混使其分布均匀后置于37℃、5% CO₂条件下孵育进行转染；转染6小时后更换293T培养基继续孵育；

至转染24小时后，收集12mL细胞上清液，并加入提前预热的12mL的293T培养基，继续于37℃、5% CO₂条件下孵育进行转染；

至转染54小时后第二次收集细胞上清液，与首次收集上清液混合，得细胞上清液；

在室温下，将上一步骤收集的细胞上清液以2000rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀物，再使用0.45μm滤器过滤上清，得病毒上清液；

按照病毒上清液与浓缩试剂以体积比5:1的比例混合，4℃孵育2h，然后于4℃处离心至离心管底有米白色沉淀；

小心移去上清，加入适量体积的DMEM重悬沉淀，得到慢病毒浓缩液，测定其病毒滴度；

(3)T细胞制备：

向含有1mL全血的EP管内添加生物素标记CD8抗体，室温混合30分钟；

再向上述1mL全血内添加150μL微泡，室温混合20分钟，将微泡和被抗体标记的细胞结合，离心；

用200µL移液枪将白色微泡层轻轻转移至另一个2mL的EP管内，用500μL微泡缓冲液冲洗附着在管壁和移液管头上的微泡，并入EP管内，室温下孵育30min；上述微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1%人血清白蛋白、2mM EDTA；

用超声波破泡，离心，收集细胞沉淀，制得T细胞为CD8⁺T细胞，对其进行流式细胞仪鉴定；

(4)T细胞激活、转导与扩增：

将收集的CD8⁺ T细胞以5x10⁵个细胞/mL接种于24孔板/6孔板中，使用激活培养基刺激24-48小时，接着加入MOI=10的慢病毒浓缩液以及转导培养基进行病毒转导，24-48小时后换成维持培养基；扩增至6-8天时，收获CAR-T细胞；

其中，所述A液-B液混合液是将A液与B液混匀后置室温孵育15min得到的；A液配置方法为：将Opti-MEMI减血清培养基恢复至室温，使用1.5ml的Opti-MEMI与41µL的Lip3000在10cm皿中混匀，得A液；B液配置方法为：将1.5ml的Opti-MEMI、35µL的P3000Enhancer、12µg质粒混合物混合，得B液；其中，质粒混合物的质粒比为，PMD2.G：pSPAX2：CAR-19-1=1:3:4。