[发明专利]一种高产维生素K2的重组纳豆枯草芽孢杆菌，制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种高产维生素K2的重组纳豆枯草芽孢杆菌。该菌株包括纳豆枯草芽孢杆菌为载体骨架，以及编码以下基因的核苷酸序列：色氨酸正反馈激活信号肽PtrpSP，毒性多肽txpA及细胞壁肽链内切酶cwlO，莽草酸激酶AroK，分支酸合成酶AroF及1，4‑二羟基‑2萘甲酸盐‑聚异戊二烯转移酶MenA。该重组纳豆枯草芽孢杆菌以纳豆枯草芽孢杆菌为受体菌株，通过调控MK‑7合成途径中的多个关键酶以提高重组菌中MK‑7的产量，发酵96h时相比于野生型菌株MK‑7的产量增加了125％，将使得发酵生产维生素K2具有巨大的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术，尤其涉及一种高产维生素K2的重组纳豆枯草芽孢杆菌，制备方法和用途。

背景技术

维生素K2也称为甲萘醌，是一种必不可少的脂溶性维生素，它存在许多不同的异构体，根据其分子结构上C3位异戊二烯单位的个数，以MK-n表示，其中以MK-7生物活性最高，半衰期最长。维生素K2可以通过促进肝脏合成凝血酶原，调节多种凝血因子的合成，也是骨钙素羧化的必要辅因子，在骨骼发育中起到重要作用，并有助于将钙离子转移到骨骼中，在凝血和预防骨质疏松症能起到关键的作用，被认为是第四代抗骨质疏松症的治疗药物。另外，作为呼吸代谢中的电子传递载体，维生素K2也参与了生物体内许多重要的代谢反应。近年来的研究发现，维生素K2在临床应用上还有许多不同的功能，例如可用来预防治疗心脑血管疾病、帕金森症及II型糖尿病，促进肝脏功能的恢复等，在医药及食品等领域具有广阔的应用前景。

人体无法合成维生素K2，仅能从食物或营养保健品中进行补充。但是，在正常食物当中维生素K2的含量很少，如，6kg猪肉或7kg鸡蛋中只有约1mg维生素K2，因此需要从其他来源进行补充。目前，维生素K2的生产来源主要有三种：(1)从植物或动物中提取；(2)化学合成；(3)微生物发酵。其中天然提取法产量低，化学合成方法步骤复杂、收率低，并且化学合成易产生低活性的不同顺式异构体及大量的副产物，并造成环境污染，较难形成大规模的生产。而微生物发酵法具有污染小、成本低、产品活性高、生产规模易于放大等特点，利用微生物资源生产维生素K2的方式已经成为未来的发展趋势。

近年来，维生素K2的制备和工业化已成为研究的重点，其中以MK-7的相关产品应用最广，而在可产生MK-7的菌株当中，芽孢杆菌属的菌株由于其安全性和较高含量的MK-7，是微生物生产维生素K2的主要潜力菌株，在这之中的纳豆枯草芽孢杆菌被认为是具有大规模生产维生素K2(MK-7)的潜力。然而，由于合成MK-7的代谢途径非常复杂，其中涉及到糖酵解途径、磷酸戊糖途径、甲羟戊酸途径和甲萘醌途径等多个途径，导致维生素K2的合成代谢流较低，在野生菌株中的甲萘醌含量一般保持在极低的水平。

通过基因工程改造现有菌种，是提高维生素K2发酵水平的一种重要手段，Ma等人通过基因改造过表达不同组合的MK-7限速酶，使重组菌株中MK-7含量从4.5mg/L增加至50mg/L(Ma X.C.,et al.Bioprocess Biosyst Eng.2019May；42(5):817-827.)。Yang等人(Yang S.M.,et al.ACS Synth Biol.2019Jan18；8(1):70-81.)将MK-7生物合成途径分为多个模块，并尝试对不同模块进行增强，最后将多个模块整合后获得的改造菌株可产生69.5mg/L的MK-7，与起始菌株相比增幅超过20倍。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产维生素K2的重组纳豆枯草芽孢杆菌。其利用信号肽响应机制抑制色氨酸代谢旁路促进维生素K2的代谢合成，从而达到高产维生素K2的目的。

为实现上述目的，本发明提供一种高产维生素K2的重组纳豆枯草芽孢杆菌，其特征在于，该菌株包括纳豆枯草芽孢杆菌为载体骨架，以及编码以下基因的核苷酸序列：色氨酸正反馈激活信号肽PtrpSP，毒性多肽txpA及细胞壁肽链内切酶cwlO，莽草酸激酶AroK，分支酸合成酶AroF及1，4-二羟基-2萘甲酸盐-聚异戊二烯转移酶MenA。