[发明专利]一种以葡萄糖为底物生物合成罗汉果醇的工程菌株、构建及其应用

权利要求书

1.一种以葡萄糖为底物微生物合成罗汉果醇的工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)利用酵母自身的同源重组系统在Gal7位点过表达角鲨烯环氧化酶ERG1和角鲨烯合酶ERG9；

(2)敲除羊毛甾醇合酶ERG7位点，在该位点调控HMGS和截短HMGR的表达，获得改造酵母工程菌；

(3)构建过表达葫芦烯二醇合酶CDS的质粒，和过表达环氧化物水解酶EPH、细胞P450酶CYP87D18和NADPH细胞P450还原酶的质粒；将质粒转入步骤(2)的改造酵母中，得到得到产罗汉果醇的酵母工程菌。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)中截短HMGR指羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶蛋白截短了前400-551个氨基酸，优选截短羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶蛋白前500-551个氨基酸。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(3)具体为:使用酿酒酵母中拷贝质粒pRS425过表达葫芦烯二醇合酶CDS和高拷贝质粒pRS313表达环氧化物水解酶EPH、细胞P450酶CYP87D18和NADPH细胞P450还原酶构建罗汉果醇生物合成模块。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的酵母为酿酒酵母。

5.一种以葡萄糖为底物微生物合成罗汉果醇的工程菌，其特征在于：酵母工程菌中整合了葫芦烯二醇合酶CDS基因，环氧化物水解酶EPH基因、细胞P450酶CYP87D18基因和NADPH细胞P450还原酶基因。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述的酵母工程菌上过表达角鲨烯环氧化酶ERG1和角鲨烯合酶ERG9，和/或所述酵母工程菌中敲除羊毛甾醇合酶ERG7位点，在该位点调控HMGS和截短HMGR的表达。

7.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述截短HMGR指羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶蛋白截短了前400-551个氨基酸，优选截短羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶蛋白前500-551个氨基酸。

8.一种以葡萄糖为底物生物合成罗汉果醇的工程菌株在生物合成罗汉果醇中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用：所述的应用方法为：

将以葡萄糖为底物生物合成罗汉果醇的工程菌株培养，获得种子液；

将种子液接种到含有葡萄糖、氮源、金属元素和维生素的培养基中，分批流加补料发酵合成罗汉果醇；发酵过程中：分批补料葡萄糖控制葡萄糖浓度在10-15g/L。

10.根据权利要求8所述的应用：所述的发酵温度为28-32℃；发酵时间优选为120-144h；发酵过程中pH控制范围为4.5-5.5；溶氧量不高于40％。