[发明专利]α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及α‑1,2‑岩藻糖基转移酶突变体及其应用。传统认为乳糖并不是α‑1，2‑岩藻糖基转移酶的天然底物，而本发明提供的α‑1,2‑岩藻糖基转移酶突变体，通过定点突变改造α‑1,2‑岩藻糖基转移酶获得α‑1,2‑岩藻糖基转移酶突变体，构建其基因工程菌并应用在高效催化岩藻糖基化寡糖生产中。α‑1,2‑岩藻糖基转移酶经替换多个氨基酸残基能够以乳糖为底物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其应用。

背景技术

α-1,2-岩藻糖基转移酶属于岩藻糖基转移酶家族，催化鸟苷二磷酸活化的岩藻糖基转移到半乳糖基连接的受体底物上，形成α-1,2-糖苷键。例如，GDP-L-岩藻糖和乳糖在α-1,2-岩藻糖基转移酶的催化下可以生成2’-岩藻糖基乳糖，其在促进健康肠道菌群构建、免疫系统发育、过敏性疾病预防和大脑功能发展等方面发挥着极其重要的作用。

目前用于合成岩藻糖基化产物的方法包括化学法和生物法。化学法包括分离提取和从头合成。分离提取是指从样品中(如母乳)对岩藻糖基化寡糖进行分离和提纯，这种方法受制于样品的多少，且损失极大。从头合成法是通过合成化学基团实现每个基团组装，但这常常伴随着反应步骤多、条件复杂不好控制、存在有毒有害试剂参与等问题。生物法包括全细胞发酵和酶法合成，因其条件温和、专一性强等优势，是目前主要采用的方法。

目前岩藻糖基化产物合成主要是通过全细胞发酵，即通过在基因工程菌株中构建所需代谢途径并转入α-1,2-岩藻糖基转移酶基因来实现产物合成。国外已有公司以该法实现了岩藻糖基化寡糖的商业化。而在我国，该法由于转基因工程菌参与，尚未获得行业应用批准。除此之外，全细胞发酵生产工艺的缺陷还表现在其最终产物的产量还处于较低水平，存在较大提升空间。这是由于现已发现的α-1,2-岩藻糖基转移酶表现出的活性并不能满足工业需求，极大程度限制了其大规模应用。

随着人们对于岩藻糖基化产物的需求日益增加，运用基因工程技术改良、创制酶分子及其基因工程菌株以期获得功能强化的α-1,2-岩藻糖基转移酶成为了生物催化领域的发展趋势。目前针对α-1,2-岩藻糖基转移酶催化活性的改造还未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其应用，以期提高岩藻糖基转移酶的活性，并扩大其底物识别范围。

本发明提供的α-1,2-岩藻糖基转移酶的突变体，其野生型的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述突变体包括如下突变位点中的至少一个：

N14M，Q15C，M16T，F17Y，F21A，Q71S，L73K，V88N，S89A，F94D，E95I，Y96S，L100F，F109I，G111N，Y112I，F113R，Q114V，D115F，P116N，R117K，Y118T，V172Y，I175F，C179E，K206W，Y249C，S250T，W251N，W252I，A254F，Y255F，I264V，G266C，P267Y，H269W，L271S，G273C，H274G，N276Y，V283N，K284F或V291L。

一些实施例中，所述突变体的突变位点的数量为1～11。

一些具体实施例中，所述突变体中的突变位点为N14M、Q15C、M16T、F17Y、F21A、Q71S、L73K、V88N、S89A、F94D、E95I、Y96S、L100F、F109I、G111N、Y112I、F113R、Q114V、D115F、P116N、R117K、Y118T、V172Y、I175F、C179E、K206W、Y249C、S250T、W251N、W252I、A254F、Y255F、I264V、G266C、P267Y、H269W、L271 S、G273C、H274G、N276Y、V283N、K284F或V291L中的任意一个；

或为H269W和 V172Y；