[发明专利]一种用于检测胰腺癌细胞的表达基因、应用及其检测方法

权利要求书

1.一种用于检测胰腺癌细胞的表达基因，其特征在于，该表达基因为MYEOV。

2.一种检测胰腺癌细胞中表达基因的检测方法，其特征在于，选取Capan-2细胞，以MYEOV作为表达基因，进行RT-PCR检测实验，并在进行RT-PCR检测实验之前，先进行细胞培养。

3.根据权利要求2所述的一种检测胰腺癌细胞中表达基因的检测方法，其特征在于，所述Capan-2细胞进行细胞培养的方法包括如下步骤：

步骤10、细胞复苏，37℃快速解冻后，加入完全培养基并离心弃去上清液，再次加入完全培养基后，于37℃，5％CO₂的条件下培养；

步骤11、观察生长情况，当细胞密度达到80％以上时，进行传代；

步骤12、收集培养基，离心弃去上清液后，补加完全培养基；

步骤13、细胞量达到10⁷后离心收集细胞，并用PBS洗2次后得到培养后的细胞并待用。

4.根据权利要求2所述的一种检测胰腺癌细胞中表达基因的检测方法，其特征在于，所述Capan-2细胞进行RT-PCR检测实验的方法包括如下步骤：

步骤20、对培养后的细胞进行RNA提取，将细胞加入Trizol裂解液进行裂解，吹打混匀后加入氯仿，离心弃去上清液后加入异丙醇颠倒混匀，离心弃去上清液后加入75％乙醇洗涤沉淀，离心弃去上清液后，加入DEPC处理水稀释溶解RNA；

步骤21、逆转录cDNA，将稀释过的RNA进行RT，其反应体系的总体积为20μL，其反应条件为42℃40min；

步骤22、qRT-PCR，将制备好的cDNA进行PCR扩增，其扩增体系的总体积为20μL，其反应条件为94℃10min，40个循环；

步骤23、荧光定量PCR仪检测，并以GAPDH作为内参，采用2^-△△CT法进行表达量的分析。

5.根据权利要求4所述的一种检测胰腺癌细胞中表达基因的方法，其特征在于，所述MYEOV包括如SEQ ID NO：1所示的上游引物，和如SEQ ID NO：2所示的下游引物；

GAPDH包括如SEQ ID NO：3所示的上游引物，和如SEQ ID NO：4所示的下游引物。

6.一种检测胰腺癌细胞中表达基因的应用，其特征在于，选取Capan-2细胞，以MYEOV作为表达基因，放置于低氧压力下进行Western Blot检测实验，该基因表达量的增加和氧气浓度呈负相关性，和同一氧气浓度下的培养时间呈正相关性。

7.根据权利要求6所述的一种检测胰腺癌细胞中表达基因的方法，其特征在于，所述Capan-2细胞进行Western Blot检测实验的方法包括如下步骤：

步骤30、对培养后的细胞进行样品准备，将细胞加入RIPA裂解液和PMSF进行裂解，离心后进行蛋白质定量并贮存；

步骤31、制备PAGE胶；

步骤32、上样及电泳，将配置好的PAGE胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液后，调整电压和时间，当染料到达胶底部时，停止电泳；

步骤33、转膜，将胶移入转膜缓冲液中，在转膜装置上从负极到正极放置垫片、滤纸、胶、膜、滤纸、垫片，并除去气泡，于电压200mA的条件下，按每1KD 1min进行转膜；

步骤34、膜的封闭及抗体孵育，采用5％脱脂奶粉进行室温封闭后，一抗加入封闭液中稀释，与膜孵育4℃过夜，按1:5000稀释与一抗相对应的二抗，并与膜孵育37℃1h；

步骤35、显色，用移液器吸取发光液至覆盖PVDF膜，于ECL发光仪上曝光并采集图像。