[发明专利]一种细胞因子检测试剂盒的开发方法

说明书

本发明公开了一种细胞因子检测试剂盒的开发方法。本发明中，加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后就可以结束标记抗体的过程；试产品各组分的形式及保存稳定性；测试各组分的保存形式，以及在2‑8度下的稳定性，未开封应至少保存18个月，开封后保存30天，从而完成细胞因子检测试剂盒的开发；实现自主标记微球、搭配组合检测因子，形成适应市场需求的产品，为进入临床市场打下基础，并在国内同行业中处于领先地位；与商品化的产品相比，在准确度、灵敏度、特异性、稳定性、检测因子数量等方面接近或达到国内外厂家的领先水平。

技术领域

本发明属于细胞因子技术领域，具体为一种细胞因子检测试剂盒的开发方法。

背景技术

细胞因子是指由免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。检测细胞因子水平可用来监测人体的免疫状态，辅助各类疾病(如炎症、肿瘤、自身免疫病和移植排斥等)的诊断及预后。但由于检测的细胞因子较多，如果采用单个因子检测，需要大量的样本，且总的操作时间较长，影响临床诊断出具报告的及时性。当前检测多因子的仪器有Luminex和流式，采用的编码微球有磁性和非磁性两种，磁性的微球为粒径相同的二维荧光编码微球，通过两种不同的荧光染料组合进行区分，理论上可同时检测数百种因子，非磁性的微球通常为2种不同粒径的一维荧光编码微球，可检测几十种因子。

但是常见的检测试剂盒在准确度、灵敏度、特异性方面都不够高，从而使得检测时不够精确。

发明内容

本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种细胞因子检测试剂盒的开发方法。

本发明采用的技术方案如下：一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，所述细胞因子检测试剂盒的开发方法包括以下步骤：

S1:查找合适的荧光编码微球；根据拟开发产品所检测的因子数量及适用仪器，确定合适的荧光编码微球；

S2:摸索微球标记抗体的方法；取来离心机和50μl微球，将微球加入到离心机的内部，开始对微球进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；

S3:加入80μl 50mM且pH为5.0MES溶液，涡旋振荡20秒，超声20秒，加入10μl 50mg/ml EDC和10μl 50mg/ml sulfo-NHS，涡旋振荡混匀；

S4:室温避光振荡孵育20分钟，孵育结束后，1000×g离心10分钟，弃上清

S5:加入50mMMES重悬沉淀，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后使用清水再对溶液重复洗涤一次备用；

S6:取70～～90μl抗人IL-6抗体，加入脱盐柱脱盐一次；

S7:将脱盐后的IL-6抗体加入微球中，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，等其混合均匀之后，室温避光振荡孵育2小时；

S8:加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；

S9:筛选标准品稀释液，测试样本类型，确定线性范围、最低检测限，测试准确度筛选标准品稀释液，测试不同的样本类型，使检测结果的相对偏差在±15％以内；确定线性范围和最低检测限；