[发明专利]一种包含氨肽酶Amp0279编码序列的重组质粒、重组谷氨酸棒状杆菌及应用

说明书

本发明公开了一种球形赖氨酸芽孢杆菌C3‑41来源的氨肽酶Amp0279的基因及氨基酸序列，构建了包含该酶编码基因的重组质粒和重组谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum CGMCC1.15647(pXMJ19‑5.7‑amp0279)。将该酶在大肠杆菌中异源表达，利用镍柱亲和层析的方法将其纯化，并以Leu‑pNA为底物检测纯化蛋白的酶学性质。本发明提供的氨肽酶Amp0279最适反应温度是50℃，最适反应pH为8.0，在40‑55℃，pH6.0‑9.0范围内酶活力稳定，在加入100μMCo²⁺后，比酶活力可达35383U/mg，适用于饲料、食品、酿造和医药等工业领域。

技术领域

本发明属于蛋白质工程和基因工程领域，具体涉及一种包含氨肽酶Amp0279编码序列的重组质粒、重组菌株及应用。

背景技术

在发酵、陈化等食品加工过程中，蛋白质会经蛋白酶、肽酶水解成多肽或氨基酸等小分子物质，或破坏致敏表位，降低致敏潜力，更利于人体摄入和吸收。蛋白质水解物因而在食品工业中应用广泛。但蛋白质水解过程会产生苦味肽，影响食品的风味，阻碍蛋白质水解物的推广。氨肽酶(EC 3.4.11.-)是一类对蛋白质水解产物有脱苦作用的酶，能够特异性水解苦味肽氨基末端疏水氨基酸残基，一次释放一到三个氨基酸，破坏苦味肽结构，达到脱苦的效果。氨肽酶广泛存在于真菌、动植物中，种类繁多，常常用其定位区域(比如细胞膜、胞浆)来命名亚型。氨肽酶也可像羧肽酶一样按照活性中心分为丝氨酸氨肽酶、金属氨肽酶和半胱氨酸氨肽酶。70％以上的氨肽酶为金属酶，其活性中心含有一个或两个二价金属离子，常见的金属离子有Zn²⁺、Co²⁺和Mn²⁺等，对酶的蛋白结构有稳定作用。氨肽酶也可根据底物分为三类：一是具有广泛特异性的氨肽酶，比如亮氨酰氨基肽酶、膜和胞浆丙氨酰氨基肽酶等；二是具有狭窄特异性的氨肽酶，比如偏好碱性氨基酸底物的氨基肽酶B、偏好酸性氨基酸底物的谷氨酰氨基肽酶、天冬酰氨基肽酶、对特定氨基酸偏好的半胱氨酰氨基肽酶、蛋氨酰氨基肽酶、脯氨酰氨基肽酶等；三是切割氨基末端2-3个氨基酸短肽的酶。氨肽酶可作为风味蛋白酶，在烘焙、酿造和奶酪制作等食品加工过程中用于去除多肽的苦味；此外，氨肽酶可被应用于生物肽和氨基酸的合成，并被发现比化学合成更有效；而且，氨肽酶能够水解有机磷化合物，因此具有营养学、生物学和生态学意义。目前，商业化的氨肽酶较少，水解位点较单一。挖掘新的氨肽酶，具有重要的应用和推广价值。

球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)是一种产生芽孢的革兰氏阳性菌。部分菌株对蚊虫具有特异性毒杀作用、或抑制病原(真)菌甚至肿瘤细胞等能力；同时该种属细菌具有特殊的代谢合成能力，在媒介蚊虫的生物防治、能源利用和植物保护等领域展示了广泛的应用前景。球形赖氨酸芽孢杆菌不能代谢糖类。与蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌相比，它具有更丰富的氨基酸转运和代谢编码基因。而且其野生型菌株中表达的杀蚊毒素蛋白占主导地位，其他蛋白产量较少。因此推测其氨基酸相关蛋白酶可能会具有较高活性，满足自身对氨基酸的代谢需求。所以，可以利用球形赖氨酸芽孢杆菌的氨肽酶编码基因。

发明内容

本发明将来源于球形赖氨酸芽孢杆菌的氨肽酶编码基因amp0279构建到大肠杆菌表达载体，获得重组质粒pET28a-amp0279，转化大肠杆菌后获得重组菌株BL21(pET28a-amp0279)，将分泌表达的该酶纯化后，以Leu-pNA为底物，利用对硝基苯胺法检测其酶学性质，确定了其反应最优条件。因考虑到大肠杆菌表达系统需要复杂耗时且增加成本的纯化和去除标签的流程，本发明进一步开发氨肽酶Amp0279的分泌表达系统，获得更为优良的重组质粒和重组菌株，具体内容如下。

一种包含球形赖氨酸芽胞杆菌C3-41来源的氨肽酶Amp0279编码序列的重组质粒pXMJ19-5.7-amp0279，所述重组质粒pXMJ19-5.7-amp0279核酸序列为SEQ ID NO:4所示。

以及含有权利要求1所述的重组质粒pXMJ19-5.7-amp0279的重组菌株。