[发明专利]一种鉴定和筛选高苦茶碱茶树的功能标记及其应用

说明书

一种鉴定和筛选高苦茶碱茶树的功能标记及其应用，属于生物技术领域。本发明一方面提供了一种茶树苦茶碱合成酶基因功能标记，另一方面提供了一种茶树苦茶碱合成酶基因功能标记的应用及应用方法。与现有的技术相比，本发明的开发的功能标记能够避免传统生化鉴定周期长、效率低的缺点，可快速有效地鉴别出苦茶碱含量高的茶树材料，加快育成高苦茶碱茶树的步伐。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定和筛选高苦茶碱茶树的功能标记及其应用。

背景技术

茶组植物中嘌呤生物碱包括咖啡碱(1,3,7-三甲基黄嘌呤，caffeine)、可可碱(3,7-二甲基黄嘌呤，theobromine)、茶叶碱(1,3-二甲基黄嘌呤，theophylline)以及苦茶碱(1,3,7,9-四甲基尿酸，theacrine)等。大多数茶组植物的嘌呤生物碱以咖啡碱为主，约占干重的2％～5％，仅在少数特异资源中检测到苦茶碱。

1937年，日本科学家Jhonson首次在几百万镑被提取了咖啡碱的茶叶残渣中分离并测定了苦茶碱的结构，但含量极低。叶创新等人于1999年利用高压液相色谱法首次从苦茶一芽二叶中分离并检测出苦茶碱，约占干重的1.29％。苦茶碱具有镇静催眠、保护神经、抗抑郁、消炎镇痛、预防非酒精性脂肪等生理功能(Sheng et al.,2020)，但是目前我国含有苦茶碱的茶树资源相对稀缺且含量较低，例如，Zheng等(2002)检测苦茶萌发芽、嫩叶和成熟叶中苦茶碱的含量，发现嫩叶和芽中的苦茶碱含量要明显高于成熟叶，说明在苦茶叶片中苦茶碱的含量可能随着叶片成熟度的增加而减少。Yang等(2007)利用高效液相色谱法(HPLC)分析了茶树、白毛茶以及苦茶中的嘌呤生物碱以及儿茶素的含量，发现除了苦茶中含有苦茶碱外，在茶树以及白毛茶中并没有苦茶碱的存在。Li等(2017)利用高效液相色谱法(HPLC)和快速液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术(UFLC-Q-TOF-MS/MS)分析在茶树、白毛茶、普安茶以及苦茶茶叶中嘌呤生物碱的含量，发现普安茶(0.79％)以及苦茶(1.88％)中都含有苦茶碱。最近也有研究发现秃房茶中也存在苦茶碱，且含量随着芽叶成熟度的增加而升高(滕杰等，2018)。近期本团队研究发现在福建山区种植的白芽茶中部分单株中苦茶碱含量超过1.00％，并且这两种成分随着叶片成熟度的增加而增加，但咖啡碱随着芽叶成熟度的增加而明显减少(Jin et al.,2020)。

Zheng等(2002)通过同位素标记证明咖啡碱是合成苦茶碱的主要原料，通过氧化、异构化和甲基化反应生成苦茶碱，但并未找到合成苦茶碱的关键酶类。直至2020年，Zhang等(2020)在苦茶叶片中确定了三种参与咖啡碱的生物合成N-甲基转移，结合酶学研究和动力学分析，发现了具有N9-甲基转移酶功能的苦茶碱合成酶(Theacrinesynthase,TcS)，该酶能催化1,3,7-三甲基尿酸甲基化生成苦茶碱。

有研究表明，一些特殊人群如老人、小孩、孕妇等摄入过量的咖啡碱会引起焦虑、兴奋、失眠等现象，因此，为满足特殊人群的要求，最为经济有效的方法是培育低咖啡碱的茶树品种。咖啡碱作为苦茶碱合成的前体物质，茶树中合成高含量的苦茶碱在一定程度上能够降低茶叶中咖啡碱的含量，是培育低咖啡碱茶树品种的一个重要途径。基于苦茶碱独特的药理功效以及资源稀缺的现状，培育高苦茶碱茶树品种不仅能满足大众日益追求健康、新颖茶的消费需求，且能显著提高茶叶生产者的经济效益。

以高苦茶碱的特异资源为亲本进行有性杂交是培育高苦茶碱茶树新品种的重要手段，但采用生化鉴定方法检测茶树中苦茶碱含量，耗费时间长，且需要多年多点鉴定。而基于基因特定序列开发的功能标记，能与目的基因共分离，提高了育种的选择效率及准确性，帮助快速鉴定和筛选含有高苦茶碱的茶树材料。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于乳源群体种与不同遗传背景茶树资源中苦茶碱合成酶基因启动子序列上存在的插入/缺失(InDel)突变开发的分子标记，及其应用在鉴定和筛选乳源群体种及其杂交后代中高苦茶碱茶树材料的技术方案。

本发明具体通过以下技术内容实现：