[发明专利]核苷酸扩增反应

说明书

本发明涉及核苷酸扩增反应。方法包括使一种多核苷酸与一种扩增试剂混合物混合形成一种反应混合物，其中反应混合物包括在溶解状态下的能可逆结合的二价离子，和调节反应混合物的pH来释放可逆结合的二价离子，从而启动多核苷酸的扩增。

本申请是申请日为2013年6月7日的中国专利申请201380029231.9“核苷酸扩增反应”的分案申请。

技术领域

本发明涉及核苷酸扩增反应。

背景知识

很多酶，几乎囊括了所有与核苷酸和大多数蛋白酶互作的酶，都需要二价离子的辅助。例如包含在核苷酸扩增反应中的酶通常需要二价镁离子(Mg++)作为辅助剂。

核苷酸扩增能够产生非特异性的扩增产物。在很多情况下，这是由于在扩增程序发生之前，非特异的寡核苷酸就可以启动和随后的引物延伸，这是因为所用的酶在室温时通常是有活性的。例如，由于引物二聚体和随后的延伸导致的扩增产物可以经常被观察到。用于克服这个问题的常用方法包括所谓的“热启动”反应，其中被包括在扩增反应中(如酶或二价镁离子辅助因子)的至少一种成分要么与反应混合物分开，要么保持失活状态，直到反应混合物的温度达到适宜的温度。

发明内容

本发明是基于，至少部分基于，控制酶促反应改进的方法。

本发明也基于，至少部分基于，核苷酸扩增方法和组成成分的改进，该核苷酸扩增具有利用简单试剂进行热启动的优势。

一方面，本发明提供了一种方法包括：(a)使多(聚)核苷酸和扩增试剂混合形成反应混合物，其中，反应混合物包括当处于溶液中的可逆结合的二价离子，和(b)调节反应混合物中的pH值来释放该可逆结合的二价离子，从而启动多核苷酸的扩增。

在一些实施例中，二价离子从下列组合中选择：镁、钙、铜、锌、锰、铁、镉和铅。

在一些实施例中，二价离子是镁。

在本发明的任意实施例中，扩增试剂混合物可以包括一种pH敏感螯合剂。这种pH敏感螯合剂可以从下列组合中选择：乙二醇-双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)，EGTA的衍生物，和EDTA的衍生物。优选的溶液中的二价离子能与pH敏感螯合剂可逆结合。优选的pH敏感螯合剂是乙二醇-双(2-氨基乙醚)四乙酸。

在本发明的任意实施例中，扩增试剂混合物可以包括一种温度敏感缓冲液。在一些实施例中，温度敏感缓冲液可以包括三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane)。

在本发明的任意实施例中，反应混合物的pH可以通过温度敏感缓冲液的pH而被调节。

在本发明的任意实施例中，通过改变反应混合物的温度从第一温度到第二温度，反应混合物的pH可以被调节。

在本发明的任意实施例中，在第二温度时温度敏感缓冲液的pKa的值至少低于在第一温度时温度敏感缓冲液的pKa值的0.4。

在本发明的任意实施例中，温度敏感缓冲液的ApKa值在-0.04℃^-1和-0.015℃^-1之间。

在本发明的任意实施例中，第一温度在约0℃和10℃之间，约10℃和20℃之间，或约20℃和30℃之间。优选的第一温度在约20℃和30℃之间。

在本发明的任意实施例中，第二温度在约30℃和40℃之间，约40℃和50℃之间，约50℃和60℃之间，约60℃和70℃之间，约70℃和80℃之间，约80℃和90℃之间，或约90℃和100℃之间。优选的第二温度在约50℃和60℃之间。

在本发明的一些特异实施例中，第一温度在约20℃和30℃之间，第二温度在约50℃和60℃之间。