[发明专利]一种蛋白印记膜再生液的制备方法

说明书

本发明涉及分子印迹技术领域，具体涉及一种蛋白印记膜再生液的制备方法，采用盐酸胍处理蛋白酶K溶液，得到处理后蛋白酶K溶液；将低活性蛋白酶K与复合盐溶液混合配置，调节pH值，得到蛋白印迹膜再生液，蛋白酶K能够将蛋白酶解成小片段多肽，从而使模板蛋白更容易从孔穴中洗脱出来，达到比较好的洗脱效果，通过盐酸胍处理蛋白酶K溶液能够使蛋白酶K进行一定程度上的去折叠，蛋白酶K的活力与构象具有较强的相关性，通过诱导蛋白酶K进行去折叠处理，能够降低蛋白酶K的活性，从而保障洗脱后留下较多的有效识别位点，从而能够直接进行其他蛋白的检测，本发明具有比较好的效果和洗脱效率。

技术领域

本发明涉及分子印迹技术领域，具体涉及一种蛋白印记膜再生液的制备方法。

背景技术

蛋白印迹是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种试验方法，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

具体试验方法为经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型，及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

在蛋白印迹中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测其他蛋白进行比较，蛋白印迹膜再生液中的特殊成分可以解离膜上的抗原与抗体的结合，但是影响转移到膜上的蛋白，随后可以使用不同的抗体进行下一轮蛋白印迹实验，检测其他蛋白，当需要多次蛋白检测时，传统的洗脱强度过大，常常会导致固相载体上的蛋白信号减弱，并且含有刺激性强的化学物质巯基乙醇，操作不慎会对工作人员造成危害，且操作时间较长。

例如公布号CN101833008 A的发明专利中采用甘氨酸和十二烷基磺酸钠制备蛋白印记膜再生液，具有较好的洗脱效果，但洗脱强度过大，常常会导致固相载体上的蛋白信号减弱，容易破坏抗原。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种洗脱效果较好、刺激性较弱，不影响转移到膜上蛋白的蛋白印记膜再生液的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种蛋白印记膜再生液的制备方法，包括以下步骤：

1)采用盐酸胍处理蛋白酶K溶液，得到处理后蛋白酶K溶液；

2)将处理后蛋白酶K与复合盐溶液混合配置，调节pH值，得到蛋白印迹膜再生液。

蛋白酶K相对于角蛋白、血红蛋白、组蛋白等具有较好的酶解作用，能够将蛋白酶解成小片段多肽，从而使模板蛋白更容易从孔穴中洗脱出来，达到比较好的洗脱效果，通过盐酸胍处理蛋白酶K溶液能够使蛋白酶K进行一定程度上的去折叠，蛋白酶K的活力与构象具有较强的相关性，通过诱导蛋白酶K进行去折叠处理，能够降低蛋白酶K的活性，从而保障洗脱后留下较多的有效识别位点，从而能够直接进行其他蛋白的检测。

进一步的，步骤1)中，所述处理后蛋白酶K溶液内盐酸胍的浓度为2.5-4.5mol/L。

进一步的，步骤1)中，所述处理步骤为将盐酸胍加入蛋白酶K溶液中，于20-30℃保温10-15h，采用低温诱导的方法使蛋白酶K进行初步的去折叠处理，相较于高温，室温条件下的处理程度较轻，使蛋白酶K仍能保持一定的活性。

进一步的，步骤2)中，所述pH值为6-6.8，在微酸性条件下，蛋白印迹膜具有较好的渗透量，从而能够加快洗脱处理速率，也使再生液具有较好的洗脱效果。

进一步的，步骤1)中，所述蛋白酶K溶液中，蛋白酶K的浓度为0.1mg/ml。

进一步的，步骤2)中，所述复合盐溶液为氯化钠、氯化钙的混合溶液。