[发明专利]一种Dicer基因敲除的BHK-21细胞系

说明书

本发明属于分子生物学与细胞生物学领域，提供了一种Dicer基因敲除的BHK‑21细胞系，其保藏编号为CCTCC NO:C2021232。上述Dicer基因敲除的BHK‑21细胞系可用于塞尼卡增殖和塞尼卡疫苗的生产。本发明利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Dicer基因敲除的BHK‑21细胞系；该细胞系中塞尼卡病毒复制速率加快，病毒滴度显著提高，可用于塞尼卡疫苗的商业化生产。

技术领域

本发明属于分子生物学与细胞生物学领域，具体涉及一种Dicer基因敲除的BHK-21细胞系。

背景技术

塞尼卡病毒（Senecavirus A, SVA），曾被称作塞尼卡谷病毒（Seneca Valleyvirus），2016年，国际病毒分类学委员会（ICTV）将其更名为Senecavinus A，是微RNA 病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员。2007年加拿大爆发猪原发性水疱病，经水疱性疾病的病原检测确定了口蹄疫和猪水疱病等病原均为阴性而SVA为阳性，因此，SVA 是导致猪原发性水疱病的病原。起初，在猪群中偶尔能检测到该病毒，但一直未见该病毒引起疾病的报道。因此，塞尼卡被认为是一种新出现的动物传染病。2014年11月至2015年初，在巴西和美国先后爆发该病。自此，随着病例每年在新的地点出现，SVA逐渐发展成为一种全球流行的病毒。

目前国内还没有塞尼卡疫苗的上市。灭活疫苗的生产则依赖于病毒在幼仓鼠肾传代细胞BHK-21（Baby hamster kidney cell）中的复制。BHK-21细胞最早由MacPherson和Stoker于1962年利用1日龄叙利亚仓鼠肾细胞建系。该细胞生长迅速、病毒敏感谱较广，随后被用于多种病毒的增殖及疫苗生产，如口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、新城疫疫苗等。原始的BHK-21细胞为贴壁生长型细胞，不利于商业化疫苗的大规模生产。Capstick等对BHK-21细胞进行了悬浮培养驯化，并于1965年在不锈钢发酵罐中用驯化的悬浮培养型BHK-21细胞培养生产了口蹄疫疫苗，开启了利用悬浮培养BHK-21细胞生产疫苗的新时代。目前贴壁生长型BHK-21细胞主要用于实验室的前期研究，而商业化疫苗生产则完全采用悬浮培养型BHK-21细胞。尽管BHK-21细胞已经应用了50多年，除了悬浮培养驯化外，目前尚没有研究利用遗传手段改造BHK-21细胞，使其更有利于塞尼卡病毒复制，并将遗传改造后的BHK-21细胞应用于塞尼卡疫苗的生产。

1998 年，Andrew Fire和Craig Mello首次指出了导致秀丽隐杆线虫转录后基因沉默（PTGS）的致病因子是双链RNA（dsRNA），并将这种现象称为RNA干扰（RNAi）。RNA干扰（RNAi）是一种主要的抗病毒防御形式。在抗病毒RNAi的过程中，病毒复制产生的病毒双链RNA（dsRNA）复制中间体（vRI-dsRNAs）或病毒RNA二级结构产生的dsRNA被宿主核糖核酸内切酶（Dicer）酶切成21-23个核苷酸的siRNA，这些siRNA与Ago2蛋白和Dicer酶共同构成诱导沉默复合体（RISC），RISC在结合部位切割mRNA。被切割后的断裂的mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。所以Dicer是行使RNAi的关键蛋白。迄今为止，RNAi已被广泛认为是真菌，植物和无脊椎动物中最重要的抗病毒机制之一，而许多病毒编码病毒RNA沉默抑制因子（VSRs）来抵抗宿主以RNAi为基础的抗病毒能力。在BHK-21细胞中敲除Dicer，接种塞尼卡病毒是否因为不会产生RNAi抗病毒作用从而使病毒含量提高的问题还没有人研究。

发明内容

针对目前塞尼卡病毒生产细胞系滴度低等问题，本发明提供一种Dicer基因敲除的BHK-21细胞系，采用CRISPR/Cas9技术对BHK-21细胞系进行基因编辑，成功敲除了Dicer基因，该细胞系中塞尼卡病毒复制速率加快，病毒滴度显著提高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种Dicer基因敲除的BHK-21细胞系，其保藏编号为CCTCC NO: C2021232。