[发明专利]一株高效生产碱性果胶酶的重组菌及其应用

权利要求书

1.一种高效生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，包括：

将碱性果胶酶基因的突变体pelA*基因、信号肽基因连接到表达载体pPIC9K上，得到重组质粒Ⅰ；

将伴侣因子基因连接到表达载体pGAPZA上，得到重组质粒Ⅱ；

将重组质粒Ⅰ转化毕赤酵母GS115得到分泌增强型基因工程菌株；

重组质粒Ⅱ转化至所述分泌增强型基因工程菌株中，获得高效生产碱性果胶酶的重组菌；

所述信号肽为MF4I；

所述伴侣因子为KEX2；

所述碱性果胶酶基因的突变体pelA*基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；

将所述高效生产碱性果胶酶的重组菌进行发酵培养，包括：将重组菌活化后接种至生长培养基YPD中于30~34℃、220~300rpm条件下培养24~28h，然后按1~1.5%接种率再转接入诱导培养基BMGY中，于30~34℃、220~300rpm摇床培养直到OD600为18~24；然后再转接入诱导培养基BMMY中，于23~25℃、220~240rpm下每24~28h添加1~1.5％的甲醇诱导碱性果胶酶的表达；

所述培养基YPD，以1L计：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖；所述培养基BMGY，以1L计：1%酵母提取物，2%蛋白胨，0.34%YNB，1%(NH₄)₂SO₄，100mmol/L 磷酸钾缓冲液pH 6.0，1%甘油。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，甲醇诱导阶段采用溶氧关联流加方式：DO维持在10-20%。

3.利用权利要求1中所述的高效生产碱性果胶酶的重组菌生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，将活化后的菌液接种于装液量20-30％的发酵培养基中，初始搅拌转速为400-550rpm，通气量为1.5-2vvm，控制pH5.5-6.0，生长期培养温度为28-30℃；当甘油耗尽溶氧反弹时补加甘油，采用溶氧和转速偶联方式，使DO维持在20-30%；待甘油再次耗尽溶氧反弹时，饥饿培养0.5-2h，开始流加诱导培养基，同时将温度降低至24-26℃，搅拌转速升高至700-900rpm，诱导碱性果胶酶表达。