[发明专利]一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒，其特征在于：包括肠道病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液；

其中肠道病毒反应液中包含肠道病毒通用型上游引物、肠道病毒通用型下游引物、肠道病毒通用型探针、内参β-actin上游引物、内参β-actin下游引物和内参β-actin探针；

所述肠道病毒通用型上游引物序列为CTAGGGTGTCCGTGTATCC；

所述肠道病毒通用型下游引物序列为GGCCTATCCAATAGCTATATCG；

所述肠道病毒通用型探针序列为：

AATTCTTTAATTGTGACCATAAGCAGCGAATA；

所述肠道病毒通用型上游引物序列中的第8位碱基G为锁核酸修饰碱；

所述肠道病毒通用型下游引物序列中的第15位碱基C为锁核酸修饰碱基；所述肠道病毒通用型探针序列中的第8为碱基T为修饰荧光基团，第23位碱基G修饰淬灭基团，第32位A碱基为磷酸化碱基；

所述内参上游引物的序列为CTGGCACCACACCTTCTACAA；

所述内参下游引物的序列为AAACATGATCTGGGTCATCTTCT；

所述内参探针的序列为CCGTGCTGCTGACCGAGGCCC，其中，第6位碱基G修饰荧光基团，第15位碱基G修饰为淬灭基团，第21位碱基C为磷酸化碱基。

2.根据权利要求1所述的一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒，其特征在于：所述肠道病毒反应液包括酶混合物、核苷酸混合液、10xBuffer、增强剂、冻干保护剂。

3.根据权利要求1-2任一所述的一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液为肠道病毒通用型病毒样颗粒、内参β-actin病毒样颗粒的混合液，所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。

4.根据权利要求2所述的一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒，其特征在于：

所述肠道病毒反应液中的所包含的酶混合物如下：UNG酶1-10U/μL、Tth DNA聚合酶0.5-2U/μL，Vent DNA聚合酶1-2U/μL、Taq酶2-5U/μL、逆转录酶100-400U/μL、RNA酶抑制剂30-50U/μL；

和/或；

所述肠道病毒反应液中的所包含的增强剂组合如下，MnCl₂ 1.0-3.0g/L，SSB单链结合蛋白0.4-1.2g/L，焦磷酸酶0.2-0.8g/L，氯化四甲氨0.1-0.5g/L，叠氮钠0.06-0.1g/L；

和/或；

所述肠道病毒反应液中的所包含的冻干保护剂组合如下，BSA0.6-1.0g/L，明胶0.5％-2％，山梨醇糖0.5％-2％，精氨酸0.8-1.2g/L，葡聚糖0.5-1.5g/L，海藻糖0.5-1.5g/L；

和/或；

所述肠道病毒反应液中所包含的10xBuffer包括Tris-HCl10-50mM，KCl100-1000mM，Mg2SO4 20-80mM；

和/或；

所述肠道病毒反应液中所包含的核苷酸混合液包括dATP、dGTP、dUTP和dCTP，且dATP、dGTP、dUTP和dCTP分别为0.1-0.5mM。

5.一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，其特征在于，使用权利要求1-4任一项所述的试剂盒，包括如下步骤：

S100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；

S200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；

S300、加样：取出装有肠道病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各25μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；

S400、扩增和荧光信号检测，将步骤S400得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；

S500、判断样本检测结果。