[发明专利]一种具有抑菌活性的假单胞菌及其提取方法和应用

权利要求书

1.一种具有抑菌活性的假单胞菌及其提取方法和应用，其特征在于：其方法步骤为：

S1:采取土样；

S2:土壤稀释；

S3：土样菌涂板；

S4：土样菌单克隆浓缩；

S5：制备农杆菌培养基；

S6：滤纸片点样；

S7：拮抗菌筛选。

2.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的假单胞菌及其提取方法和应用，其特征在于：所述S1中用小铲子将表层的土壤刨开，取距离土表10cm深层且没有小石子的土壤。

3.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的假单胞菌及其提取方法和应用，其特征在于：所述S2中将采取的土样放到50ml的EP管里，加入10ml的水，涡旋，静止10分钟，将其进行梯度稀释，稀释倍数为10¹，10²，10³。

4.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的假单胞菌及其提取方法和应用，其特征在于：所述S3通过吸取50微升10³稀释液进行涂板，放入28℃培养箱过夜。挑单克隆：将前一天涂好的板挑取单克隆，在1mlYEB液体培养基中摇床过夜培养，摇床的培养条件28℃，200rpm。

5.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的假单胞菌及其提取方法和应用，其特征在于：所述S4通过将前一天摇好的单克隆离心，倒掉一部分上清，然后再涡旋混匀浓缩备用。

6.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的假单胞菌及其提取方法和应用，其特征在于：所述S5将50ml的EP管里加入15ml的YEB固体培养基，待培养基晾至50℃左右时，迅速再加入1ml的CFCC1369根癌农杆菌菌液，将混合好的菌液倒入已有一层空白YEB固体培养基的培养皿。

7.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的假单胞菌及其提取方法和应用，其特征在于：所述S6待培养基凝固之后用灭过菌的镊子放入适当的无菌滤纸片，再将上述浓缩好的各个待测菌液吸取5微升到不同的滤纸片上，静置10分钟后，28℃培养箱培养过夜。

8.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的假单胞菌及其提取方法和应用，其特征在于：所述S7通过1-6天观察抑菌圈的产生情况，选取培养24h后抑菌圈直径大于20mm的菌液作为候选菌株。

9.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的假单胞菌及其提取方法和应用，其特征在于：所述S7利用分子生物学及生物化学方法对拮抗菌进行分子鉴定，观察其在培养基中的菌落形态，通过利用细菌的16SrRNA引物F8(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/R1492(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增，通过目的片段测序、数据库检索，对拮抗菌进行分子鉴定。

10.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的假单胞菌及其提取方法和应用，其特征在于：所述S7从活体方面，对拮抗菌的拮抗效果进行分析验证，初步明确其作用机理，选根癌农杆菌CFCC1369以及拮抗菌分别进行培养，分别培养到OD600为0.8，然后将两种菌等体积混合，以无菌水接种以及单独农杆菌接种一个月大苗龄的番茄茎干，接种后用菌液浸湿的无菌脱脂棉包裹，保湿48h后，25-28℃光照培养箱培养，一个月后观察接种部位发病情况。