[发明专利]一种重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用

权利要求书

1.一种猫疱疹病毒gB 抗原表位重组蛋白，其特征在于所述抗原表位重组蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No.1 所示。

2.如权利要求 1 所述重组蛋白的制备方法，其特征在于步骤为：

1）获得一种重组 DNA，该重组 DNA 编码如SEQ ID No.1 所示的蛋白质；

2）将步骤 1）的重组 DNA 利用基因工程重组技术构建能够表达 gB 蛋白2段抗原优势抗区域的基因工程质粒 pET-28a △FHV-1 gB；

3）将质粒 pET-28a △FHV-1 gB 转入宿主大肠杆菌BL21 成为基因工程菌 BLpET-28a△FHV-1 gB，将 BLpET-28a △FHV-1 gB 在LB 培养基中培养，利用 IPTG 诱导表达并进行条件优化，所表达的蛋白经分析该重组蛋白在沉淀表达；

4）将重组蛋白通过亲和层析柱进行纯化。

3.如权利要求 2 所述的制备方法，其中步骤1中所述重组 DNA的获得为根据已有文献报道并参考伪狂犬病毒的抗体检测方法所选择的区域，再结合序列分析选择gB蛋白中2段抗原优势区域进行串联表达，2段序列之间加入一个柔性linker序列GGGGSGGGGS,构建成一个串联表达盒，在序列中引入BamHI限制性酶切位点和 EcoRI限制性酶切位点。

4.如权利要求1 所述的一种猫疱疹病毒gB 抗原表位重组蛋白的应用，所述应用为非诊断目的的检测FHV-1抗体的间接 ELISA 方法。

5.一种非诊断目的的测定猫疱疹病毒抗体的 ELISA 方法，其特征在于所述ELISA 方法的具体测定步骤为：

a、包被：将纯化后的重组蛋白，用抗原包被液稀释至含重组蛋白0.5 μ g/mL的终浓度，每个 ELISA 孔加入 100μ L，4℃包被过夜，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复三次；所述的抗原包被液为 0.05mol/L，pH9.6 的碳酸盐缓冲液；所述 BPST 缓冲液为含终浓度 0.01%，Tween-20 的 PBS 缓冲液；

b、封闭：每孔加入 5% 脱脂奶粉的PBST 封闭液 100μ L，37℃作用 2h，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次；

c、加待检血清：每孔加入 100μ L 用PBS稀释 1:1000 倍稀释的猫血清，37℃作用 1h，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次；

d、加酶标二抗：每孔加入100μ L 用PBS稀释 1:10000 稀释的兔抗猫IgG/ 辣根酶，37℃作用 1h，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次；

e、加显色液：每孔加入 100μ L TMB显色液，37℃作用 15min ；

f、加终止液：每孔加入50μ L 终止液，用酶标仪测定OD450 值；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；

g、结果判定：待检血清 OD450 值≧ 0.289 时，判定为 FHV-1 抗体阳性；待检血清OD450 值﹤ 0.289，判定为 FHV-1抗体阴性；其中所述的重组蛋白为权利要求1所述的一种猫疱疹病毒gB 抗原表位重组蛋白。

6.一种测定猫疱疹病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包括一种猫疱疹病毒gB抗原表位重组蛋白，其特征在于所述抗原表位重组蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No.1 所示，所述试剂盒还包括包被液，其组分为碳酸钠 1.58g、碳酸氢钠 2.93g 加去离子水定容至1L，调节p H值为9.6；

PBST 缓冲液，其组分为含终浓度 0.01%，Tween-20 的 PBS 缓冲液；

2M 的硫酸溶液，其组分为22.2mL 98%的H₂SO₄加177.2mL的去离子水定容至200mL。

7.一种预防和/或治疗猫疱疹病毒的疫苗，所述疫苗为DNA疫苗或亚单位疫苗，所述疫苗的活性成分为，包含氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的蛋白片段和/或核苷酸序列为SEQID NO .2所示的核苷酸的生物材料。