[发明专利]孔蛋白单体的突变体、蛋白孔及其应用

说明书

本发明属于靶分析物特性的表征技术领域，具体提供了一种孔蛋白单体的突变体、包含其的蛋白孔、以及其检测靶分析物的应用，其中所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括SEQ ID NO:1所示的序列或与其具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列，并且所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括在对应SEQ ID NO:1的Y76、S79、S83、和F84的一个或多个位置处的突变。

技术领域

本发明属于靶分析物特性的表征技术领域，特别涉及一种孔蛋白单体的突变体、包含其的蛋白孔以及其检测靶分析物的应用。

背景技术

随着对核酸结构和序列的研究，核酸测序技术不断发展，成为生命科学研究的核心领域，对生物、化学、电学、生命科学、医学等领域的技术发展起到巨大的推动作用。利用纳米孔研究出新型的快速、准确、低成本、高精度及高通量的核酸测序技术是后人类基因组计划的热点之一。

纳米孔(Nanopore)测序技术，又被称为第四代测序技术，是一种以单链核酸分子作为测序单元，利用一个能够提供离子电流通道的纳米孔，使得单链核酸分子在电泳驱动下通过该纳米孔，当核酸通过纳米孔时，会减少纳米孔的电流，对产生的不同信号实时读取序列信息的基因测序技术。

纳米孔测序主要特点是：读长很长，准确率较高，错误区大都发生在均聚寡核苷酸区域。纳米孔测序不但可实现天然DNA和RNA测序还可直接获取DNA和RNA的碱基修饰信息，例如它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代测序方法那样需要事先对基因组进行重亚硫酸盐(bisulfite)处理，这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大推动。纳米孔检测技术作为一个新型平台，具有低成本、高通量、非标记等优势。

纳米孔分析技术起源于Coulter计数器的发明以及单通道电流的记录技术。生理与医学诺贝尔奖获得者Neher和Sakamann在1976年利用膜片钳技术测量膜电势，研究膜蛋白及离子通道，推动了纳米孔测序技术的实际应用进程。1996年，Kasianowicz等提出了利用α-溶血素对DNA测序的新设想，是生物纳米孔单分子测序的里程碑标志。随后，MspA孔蛋白、噬菌体Phi29连接器等生物纳米孔的研究报道，丰富了纳米孔分析技术的研究。Li等在2001年开启了固态纳米孔研究的新时代。受限于半导体和材料工业的发展，固态纳米孔测序进展缓慢。

纳米孔测序技术的关键点之一在于所设计的一种特殊生物纳米孔，孔内缢缩区形成的读取头结构可在当单链核酸(例如ssDNA)分子通过纳米孔时，造成孔道电流的阻塞，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的)，最后高灵敏度的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。目前采用蛋白孔作为纳米孔进行测序，孔蛋白主要以大肠杆菌为来源。

目前纳米孔蛋白单一，需要开发替代的纳米孔蛋白实现纳米孔测序技术。孔蛋白也与测序精度密切相关，而且孔蛋白还涉及与控速蛋白的相互作用的模式变化，进一步优化孔蛋白与控速蛋白相互作用界面的稳定性，对提高测序数据的一致性和稳定性有积极影响。纳米孔测序技术的准确率也有待改善，因此，需要开发改进的纳米孔蛋白，以进一步提高纳米孔测序的分辨率。

发明内容

为解决上述问题，本发明实施例的目的在于提供一种替代的孔蛋白单体的突变体、包含其的蛋白孔、及其应用。

第一方面，本发明实施例提供了一种孔蛋白单体的突变体，其中所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括SEQ ID NO:1所示的序列或与其具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％或50％同一性的序列，或由其组成，并且所述孔蛋白单体的突变体的氨基酸包括在对应SEQ ID NO:1的Y76、S79、S83、和F84中的一个或多个位置处的突变；