[发明专利]3D肿瘤全抗原诱导激活的CTL细胞体外扩增培养方法

说明书

本发明提供了3D肿瘤全抗原诱导激活的CTL细胞体外扩增培养方法，包括如下步骤：步骤一：第1天，将外周血单个核细胞置于含有IL‑2、淋巴母细胞激活因子、自体血清的培养基中进行培养；步骤二：第3天，加入含有IL‑2、3D肿瘤全抗原、自体血清的培养基中进行诱导激活培养；步骤三：第5天，加入含有IL‑2、T细胞双信号激活因子、自体血清的培养基中进行活化增殖培养；步骤四：第7‑15天，每2天定量加入含有IL‑2、OKT‑3、灭活胎牛血清的培养基进行细胞毒性T细胞扩增培养。本发明经过15天的扩增培养可获得扩增60‑120倍的CTL细胞，且相比于未诱导的外周血PBMC具有更强的肿瘤杀伤作用。

技术领域

本发明涉及T细胞体外诱导培养及扩增技术领域，特别涉及一种3D肿瘤全抗原诱导激活的CTL细胞体外扩增培养方法。

背景技术

随着免疫学和肿瘤生物学的发展，免疫治疗作为肿瘤治疗的一种新策略，越来越受到人们的关注。其中过继性免疫细胞治疗为癌症的治疗带来了新的希望，过继性免疫细胞治疗是指通过输入自身或同种异体的肿瘤杀伤细胞来治疗肿瘤的方法。它一方面可以纠正细胞免疫功能的低下，促进宿主抗肿瘤免疫的功能，另一方面还可以直接发挥抗肿瘤的作用。

其中细胞毒性T细胞(CTL)的过继治疗有着特殊的优越性。即易获得、可操作性强、靶向性好、安全性高等特点，是实体肿瘤治疗应用研究的热点。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)通常称为CD8⁺T细胞。细胞由CD34⁺造血干细胞发育而来(这些干细胞在离开骨髓之前表达CD2、CD5和CD7标志物)。在胸腺中，这些细胞表达CD3，之后表达CD4⁺和CD8⁺(DP状态)。然后，这些细胞经过阳性和阴性克隆选择成为CD8+T-αβ细胞，被释放到循环中。抗原呈递细胞激活的CD8⁺T细胞可导致抗原特异性CD8⁺T细胞克隆扩增，然后分化为效应细胞或记忆细胞。效应细胞通过直接或间接机的方法杀死受感染细胞或癌细胞来发挥功能。CTL介导的直接杀伤需要细胞间接触，通常由细胞溶解酶(如颗粒酶B)的释放引起。CTL释放的穿孔素在靶细胞膜中“打”孔，致使颗粒酶B被动向内扩散，然后引起靶细胞凋亡。肿瘤细胞的直接杀伤也可能由CTL表达的Fas配体(Fas-L)与靶细胞表达的受体Fas相互作用导致。Fas/Fas-L的连接可通过半胱天冬酶依赖性途径导致靶细胞凋亡。除这些直接杀伤机制外，CTL还可以通过分泌细胞因子(远距离作用)间接诱导“旁邻”肿瘤细胞死亡。例如，TNFα分泌可以诱导表达TNF受体的邻近肿瘤细胞凋亡。

虽然CTL细胞具有以上诸多功能优点，但在应用方面还存在一些障碍及困难，其中最突出的一个是特异性CTL细胞的数量不足。

发明内容

为解决以上现有技术的不足，本发明提供了3D肿瘤全抗原诱导激活的CTL细胞体外扩增培养方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3D肿瘤全抗原诱导激活的CTL细胞体外扩增培养方法，包括如下步骤：

步骤一：第1天，外周血单个核细胞置于含有IL-2、淋巴母细胞激活因子、自体血清的培养基中进行培养。

可选地，步骤一中采用Ficoll密度梯度离心法从采集的外周血中分离获取外周血单个核细胞。

可选地，步骤一中所述的IL-2的浓度为100U/ml-2000U/ml；优选地，步骤一中所述的IL-2的浓度为1000U/ml。

可选地，步骤一中所述的淋巴母细胞激活因子为植物凝集素、刀豆凝集素、菜豆凝集素等的一种或任意组合，其浓度为0.1μg/ml-5μg/ml；优选地，步骤一中所述的淋巴母细胞激活因子组合为植物凝集素，浓度为2μg/ml。

可选地，步骤一中所述的自体血清浓度为1％-5％；优选地，步骤一中所述的自体血清浓度为5％。