[发明专利]基于环介导等温扩增技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于环介导等温扩增技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法。本发明方法是对致病疫霉、链格孢菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、层出镰刀菌、接骨木镰刀菌、茄丝核菌、茄科雷尔氏菌、黑腐果胶杆菌、链霉菌和粉痂菌的分子检测方法。本发明方法不需要复杂仪器，能较好满足对12种马铃薯病害病原菌的现场检测，为检疫性病害病原菌的检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对马铃薯病害的现场检测的迫切需要，用于进出口检疫、田间检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。

技术领域

本发明具体涉及一种基于颜色判定的环介导的等温扩增(LAMP)技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法，属于生物技术领域。专用于田间重要马铃薯病害病原菌：致病疫霉(Phytophthora infestans)、链格孢菌(Alternaria solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、接骨木镰刀菌(Fusariumsambucinum)、茄丝核菌(Rhizoctonia solani)、茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)、黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)、链霉菌(Streptomycesscabies)、粉痂菌(Spongospora subterranea)的高灵敏度快速检测，同时可用于田间马铃薯病害的早期诊断和病原菌的监测。

背景技术

马铃薯病害是由多种病原真菌及卵菌侵染马铃薯导致的，严重危害马铃薯生产。引起马铃薯病害的病原菌主要是致病疫霉(Phytophthora infestans)、链格孢菌(Alternaria solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、茄丝核菌(Rhizoctonia solani)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)、链霉菌(Streptomyces scabies)、粉痂菌(Spongospora subterranea)等。由上述病原菌造成的马铃薯病害包括：马铃薯晚疫病、马铃薯早疫病、马铃薯枯萎病、马铃薯干腐病、马铃薯黑痣病、马铃薯青枯病、马铃薯黑胫病、马铃薯疮痂病和马铃薯粉痂病等。这些病害分布广、危害重，往往导致农业生产的严重损失。及时对这些病原菌进行准确的检测有利于病害的快速诊断并及时指导防治。

传统的检测各种病原菌的方法是进行病原菌的分离纯化。传统方法在病原菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，基于PCR的方法已经成功用于检测病原菌，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。