[发明专利]一种制备拟南芥自噬基因突变体的方法及应用

权利要求书

1.一种制备拟南芥自噬基因ATG8九突变体的方法，其特征在于，在野生型拟南芥中，使用CRISPR/Cas9系统敲除ATG8基因的多重拷贝基因，所述的拷贝基因为ATG8a、ATG8b、ATG8c、ATG8d、ATG8e、ATG8f、ATG8g、ATG8h和ATG8i，依次对应TAIR数据库中的Locus为AT4G21980、AT4G04620、AT1G62040、AT2G05630、AT2G45170、AT4G16520、AT3G60640、AT3G06420和AT3G15580；

所述CRISPR/Cas9系统包含核苷酸序列如SEQ ID NO：10～18所示的sgRNA的编码基因；所述sgRNA的靶向位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～9所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1. 使用CRISPR/Cas9系统敲除野生型拟南芥的ATG8基因的ATG8e、ATG8f和ATG8g拷贝基因，得到纯合三突变体株系；

S2. 使用CRISPR/Cas9系统沉默纯合三突变体株系的ATG8基因的ATG8a、ATG8b、ATG8c和ATG8d拷贝基因，得到纯合七突变体株系；

S3. 使用CRISPR/Cas9系统沉默纯合七突变体株系的ATG8基因的ATG8h、和ATG8i拷贝基因，得到纯合九突变体株系。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1. 使用敲除ATG8e、ATG8f和ATG8g拷贝基因的CRISPR/Cas9载体，所述的CRISPR/Cas9载体包含核苷酸序列如SEQ ID NO：10～12所示的sgRNA的编码基因；农杆菌法转化野生型拟南芥，经筛选鉴定，得到无Cas9背景的atg8efg纯合三突变体株系；

S2. 使用敲除ATG8a、ATG8b、ATG8c和ATG8d拷贝基因的CRISPR/Cas9载体，所述的CRISPR/Cas9载体包含核苷酸序列如SEQ ID NO：13～16所示的sgRNA的编码基因；农杆菌法转化atg8efg纯合三突变体株系，经筛选鉴定，得到无Cas9背景的atg8abcdefg纯合七突变体株系；

S3. 使用敲除ATG8h和ATG8i拷贝基因的CRISPR/Cas9载体，所述的CRISPR/Cas9载体包含核苷酸序列如SEQ ID NO：17～18所示的sgRNA的编码基因；农杆菌法转化atg8abcdefg纯合七突变体株系，经筛选鉴定，得到无Cas9背景的atg8abcdefghi纯合九突变体株系。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体为pHEE401E载体。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述筛选为潮霉素筛选。