[发明专利]一种高效促进细胞外泌体分泌技术应用于骨修复材料制备

说明书

本发明通过脂质体介导Rab27a‑pcDNA3.1‑3xFlag‑C重组质粒转染hFOB1.19细胞，构建了hFOB1.19‑Rab27a细胞，转染后细胞稳定表达Rab27a基因与蛋白，能够分泌促成骨分化作用的外泌体。差速离心法提取的样品Western Blot、TEM、NTA结果符合外泌体特征。BCA、NTA检测证明，hFOB1.19‑Rab27a细胞单位时间内分泌外泌体的产量和效率显著提高。本发明为一种高效促进细胞分泌促成骨分化作用的外泌体的技术策略。

技术领域

本发明属构建hFOB1.19-Rab27a细胞进行的基础研究领域,更具体地说，本发明涉及脂质体介导Rab27a-pcDNA3.1-3xFlag-C重组质粒转染hFOB1.19细胞,能够分泌具有促成骨分化作用的外泌体。

背景技术

外泌体为细胞分泌的微小囊泡，其中含有蛋白、核酸、脂质成分，外泌体具有介导细胞间通讯的作用。近年来，通过外泌体作为药物递送体系，或使用间充质干细胞外泌体进行组织缺损修复治疗受到广泛的关注。间充质干细胞在特定诱导分化条件下进行培养，其分泌的外泌体同样具有促进细胞定向分化的功能，有研究对于成骨前体细胞 hFOB1.19、干细胞BMSCs进行成骨诱导培养并分别提取其外泌体，该外泌体对细胞成骨分化有促进作用。在骨组织工程中，虽然BMSCs作为常用的种子细胞，但是细胞系hFOB1.19较原代提取的BMSCs性质更加标准、稳定，减少了因为供体差异引起的细胞品质差异，适合用于外泌体的标准化提取方案及成分分析研究。

在外泌体的发生和分泌过程中，Rab27a基因调控在外泌体分泌过时MVB与质膜的锚定对接，促进MVB与质膜融合释放外泌体，研究显示敲低Rab27a基因明显降低了外泌体的分泌水平，造成胞内Alix标记的MVB积聚，但Rab27a表达水平的变化不会引起外泌体成分的改变。

发明内容

本发明通过脂质体介导Rab27a-pcDNA3.1-3xFlag-C重组质粒转染 hFOB1.19细胞，构建了hFOB1.19-Rab27a细胞。

附图说明

图1为本发明实施例1Rab27a pcDNA3.1-3xFlag-C质粒构建示意图。

图2为本发明实施例1重组质粒Rab27a-pcDNA3.1-3xFlag-C的双酶 切鉴定。

图3为本发明实施例1RT-PCR检测Rab27a的mRNA水平。

图4为本发明实施例1WesternBlot检测Rab27a的蛋白表达水平。

图5为本发明实施例1BCA检测外泌体蛋白浓度。

图6为本发明实施例1WesternBlot检测外泌体表面标志物。

图7为本发明实施例1透射电镜观察外泌体形貌。

图8为本发明实施例1hFOB1.19细胞内化外泌体。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1：Rab27a转染hFOB1.19细胞的构建及外泌体分泌检测材料与方法细胞和试剂：质粒Rab27a-pcDNA3.1-3xFlag-C(图1)购于武汉金开瑞生物工程有限公司，大肠杆菌DH5α菌种为实验室保藏菌株，小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)实验提取，人成骨细胞系(hFOB1.19-Rab27a)实验构建，BCA蛋白浓度试剂盒， Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒等购自Invitrogen。

实验仪器：ABI荧光定量PCR和Nanosight纳米粒径仪购自美国ABI。