[发明专利]检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，试剂盒与方法

权利要求书

1.一种用于早期检测胰腺癌的多联合基因靶点，其特征在于，包括KRAS基因的第2号外显子的第12和13密码子的7种突变型，ADAMTS1的甲基化与BNC1的甲基化。

2.根据权利要求1所述的一种用于早期检测胰腺癌的多联合基因靶点，其特征在于，所述KRAS基因的第2号外显子的第12和13密码子的7种突变型包括Gly12Ser，Gly12Aeg，Gly12Cys，Gly12Asp，Gly12Ala，Gly12Val与Gly13Asp。

3.检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，其特征在于，所述引物探针包括针对检测权利要求1-2任一项所述的7种KRAS基因突变型的捕获探针组A，检测ADAMTS1甲基化的引物探针组B，检测BNC1甲基化的引物探针组C与检测ATCB基因的引物探针组D；

所述引物探针组B包括正向引物b，反向引物b和探针b；

所述引物探针组C包括正向引物c，反向引物c和探针c；

所述引物探针组D包括正向引物d，反向引物d和探针d；

所述探针b，探针c和探针d的5’端设有报告荧光基团，所述探针b，探针c和探针d的3’端设有淬灭荧光基团。

4.根据权利要求3所述的检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，其特征在于，所述正向引物b的核苷酸序列为SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5；所述反向引物b的核苷酸序列为SEQ ID No.2，SEQ ID No.4或SEQ ID No.6；所述探针b的核苷酸序列为SEQ ID No.13。

5.根据权利要求3所述的检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，其特征在于，所述正向引物c的核苷酸序列为SEQ ID No.7，SEQ ID No.9或SEQ ID No.11；所述反向引物c的核苷酸序列为SEQ ID No.8，SEQ ID No.10或SEQ ID No.12；所述探针c的核苷酸序列为SEQ ID No.14。

6.根据权利要求3所述的检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，其特征在于，所述正向引物d的核苷酸序列为SEQ ID No.19；所述反向引物d的核苷酸序列为SEQID No.20；所述探针d的核苷酸序列为SEQ ID No.15。

7.根据权利要求4或5或6所述的检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，其特征在于，报告荧光基团包括FAM，HEX，VIC，TET，CY3，CY5或ROX，淬灭荧光基团为BHQ1。

8.根据权利要求3所述的检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，其特征在于，捕获探针组A为SEQ ID No.16与SEQ ID No.17。

9.一种检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3-8任一项所述的引物探针。

10.一种KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的检测方法，其特征在于，包括使用权利要求3-8任一项所述的引物探针或包括权利要求9所述的试剂盒；所述检测方法包括以下步骤：

1)提取生物样本中的游离DNA；

2)对步骤1)得到的部分游离DNA进行甲基化转化并纯化；

3)将步骤2)甲基化转化并纯化后的游离DNA与剩余未转化的游离DNA进行荧光定量PCR扩增，并得到结果；

其中，PCR的每个体系50μL，其中含1xPCR反应缓冲液、200-400μm dNTPs、2-7mM MgCl₂与1-5U AmpliTaq DNA聚合酶；

ADAMTS1与BNC1基因区域靶点的正向引物与反向引物各250-550nM，ADAMTS1与BNC1基因区域靶点的探针各200-400nM，ACTB基因区域靶点的正向引物与反向引物150-300nM，ACTB基因区域靶点的探针50-150nM。