[发明专利]一种新冠病毒SARS-CoV-2完整病毒颗粒的检测方法

说明书

本发明提供一种新冠病毒(SARS‑CoV‑2)完整病毒颗粒的检测方法，包括假病毒的产生与滴定、体外假病毒感染、羧基磁珠与抗体的偶联、SARS‑CoV‑2定量RT‑qPCR检测步骤。本发明对血清和HBV的抗干扰能力比直接qPCR检测更显著，检测内分析的变异系数分别为0.83%和5.19%，提示本发明方法对检测完整的SARS‑CoV‑2颗粒具有良好的特异性和稳定性。综上所述，本发明建立了一种基于伪病毒的检测SARS‑CoV‑2完整病毒颗粒的新方法，它将在许多特殊情况下对快速和准确的病毒感染风险评估发挥巨大作用。

技术领域

本发明涉及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，具体涉及一种新冠病毒(SARS-CoV-2)完整病毒颗粒的检测方法。

背景技术

由新型冠状病毒SARS-CoV-2引发的严重急性呼吸系统综合征(COVID-19)已经发展成为全球严重的公共卫生事件。尽管全球已经在COVID-19的诊断、治疗和预防上投入了巨额资金，但由于SARS-CoV-2的高传染性、致病性和突变率，疫情仍然十分严峻。病原体SARS-CoV-2是一种具有3万碱基的单股正链RNA基因组，直径约80-120nm的新型β-冠状病毒。病毒的基因组包含5个主要的开放阅读框，依次为5′非翻译区-复制酶复合物(ORF1ab)-刺突蛋白(S)-包膜蛋白(E)-膜蛋白(M)-核衣壳(N)-3′非翻译区。在细胞感染过程中，S蛋白首先与位于II型肺细胞表面的人受体血管紧张素转换酶2(ACE2)相互作用，并与宿主细胞膜融合。正义RNA被释放入胞质后移动到细胞核，首先产生非结构蛋白和病毒RNA聚合酶。RNA合成之后，由亚基因组mRNA合成病毒结构蛋白，并进一步包装成新的完整病毒粒子。子代病毒将被包裹在细胞质内的囊泡中，通过胞吐作用释放到细胞外，进行下一个病毒感染周期。然而，核衣壳蛋白可以与病毒基因组RNA形成冷凝物，并作为“亚病毒颗粒”分泌到细胞外，这是病毒生命周期中常见的现象。如，乙型肝炎病毒核心蛋白和病毒DNA可以组装成衣壳粒子并分泌，人类免疫缺陷病毒(HIV)衣壳蛋白(CA)和丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(CA)可以包裹病毒RNA并以亚病毒颗粒的形式释放。从以上SARS-CoV-2生命周期中可以看出，完整的病毒颗粒是唯一能造成持续感染的元素。

截至目前，各个领域已经开发了多种及时高效检测SARS-CoV-2感染的方法，包括基于病理的胸部计算机断层扫描、基于蛋白质的病毒抗原和抗体检测，基于病毒RNA的定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、RT-LAMP/Cas12 DETECTR检测、RPA/SHERLOCK检测和miRNA生物传感器检测。这些方法对于检测新型冠状病毒感染情况和治疗预后具有重要价值，但有些病毒成分中仅含有病毒RNA片段和/或抗原，如亚病毒颗粒，检测信号仍呈阳性，以致于不能真正反映病毒复制和感染的能力。特别是需要确定这些感染者是否能分泌完整的病毒并感染接触人群。此外，在许多特殊情况下，如COVID-19患者康复、患者所在医院周边区域、冷链物流、密闭客舱等，需要对完整病毒进行检测，以科学评估其感染人的能力。因此，迫切需要一种新的方法来检测完整的新冠病毒(SARS-CoV-2)颗粒。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明提供一种新冠病毒(SARS-CoV-2)假病毒系统。

假病毒由目标病毒的一些功能成分组成，并通过在宿主细胞内的少量繁殖来确定安全性。因此，它常被用作SARS-CoV-2病毒感染、治疗和诊断的致病模型。目前所构建的SARS-CoV-2假病毒可在病毒包膜上表达Spike(或RDB结构域)，可用于研究SARS-CoV-2的受体和感染途径，评估和量化中和抗体，构建重组疫苗。但这些缺乏病毒基因序列的假病毒不适合用于检测完整的SARS-CoV-2病毒颗粒。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：