[发明专利]一种酿酒酵母载体及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种酿酒酵母载体及其构建方法与应用，其中，酿酒酵母载体的构建方法包括步骤：以PGBKT7酵母双杂交载体为基本骨架，依次重组了35S:HYG序列片段、细菌质粒转化子相关元件序列、CEN6‑ARSH4序列片段以及MCS序列片段，获得PGBKT7‑Hyg‑pVS‑CEN6‑ARSH4‑MCS重组载体，即可用于植物人工染色体组装的酿酒酵母载体。本发明构建的所述酿酒酵母载体可用于植物人工染色体相关大片段组装，以满足植物人工染色体实验中大片段序列合成组装，以及在植物体内的功能验证，该发明具有实际的研究价值和明确的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因重组技术领域，尤其涉及一种酿酒酵母载体及其构建方法与应用。

背景技术

继DNA双螺旋发现和人类基因组测序计划之后，以基因组设计合成为标志的合成生物学引发了第三次生物技术革命。合成生物学是基于系统生物学的遗传工程和工程方法的人工生物系统研究，从基因片段、DNA分子、基因调控网络与信号传导路径到细胞的人工设计与合成。如果说基因测序是“读”基因，那么合成生物学就是“写”基因。近年来的进展表明，合成生物学有可能推动不同领域的技术革新，这些应用领域包括生物计算、生物材料、电子接口、治疗性基因编辑、多重诊断和细胞记录、第三代生物精炼和生物治疗等。目前人工合成真核生物染色体已取得重大突破，相继有团队实现了人工合成酵母染色体，以及人工合成仅含单条染色体的酵母真核细胞，而在高等真核生物中人工合成染色体尚未有所突破。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于植物人工染色体相关大片段组装的酿酒酵母载体的构建方法。

本发明的技术方案如下：

一种酿酒酵母载体的构建方法，其中，包括步骤：

提供PGBKT7酵母双杂交载体；

将所述PGBKT7酵母双杂交载体通过酶切线性化与35S:HYG序列片段同源重组，得到PGBKT7-Hyg重组载体，所述35S:HYG序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

将所述PGBKT7-Hyg重组载体通过酶切线性化与细菌质粒转化子相关元件序列同源重组，得到PGBKT7-Hyg-pVS重组载体；

将所述PGBKT7-Hyg-pVS重组载体通过酶切线性化与CEN6-ARSH4序列片段同源重组，得到PGBKT7-Hyg-pVS-CEN6-ARSH4重组载体，所述CEN6-ARSH4序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

将所述PGBKT7-Hyg-pVS-CEN6-ARSH4重组载体通过酶切线性化与MCS序列片段同源重组，得到PGBKT7-Hyg-pVS-CEN6-ARSH4-MCS重组载体，即构建得到所述酿酒酵母载体，所述MCS序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述酿酒酵母载体的构建方法，其中，所述细菌质粒转化子相关元件序列包括PVS1 StaA序列、PVS1-RepA序列和PVS1 OriV序列，其中，所述PVS1 StaA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述PVS1-RepA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述PVS1OriV序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述酿酒酵母载体的构建方法，其中，所述35S:HYG序列片段的制备包括步骤：

以pMDC83质粒为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物进行PCR扩增，得到所述35S:HYG序列片段。

所述酿酒酵母载体的构建方法，其中，所述细菌质粒转化子相关元件序列的制备包括步骤：