[发明专利]一种用于外泌体分离富集的微流控芯片，以及一种外泌体表面蛋白的分析方法

权利要求书

1.一种外泌体表面蛋白的分析方法，其特征在于，包括：

外泌体的分离富集：利用磁珠修饰的Ca²⁺离子依赖性的磷脂酰丝氨酸结合蛋白和外泌体表面暴露出的磷脂酰丝氨酸特异性结合原理，在微流控芯片中利用水滴状微柱阵列结构有效提高磁珠和外泌体的碰撞机会，从而实现外泌体的快速、高特异性识别，然后在金属离子螯合剂的作用下将外泌体从磁珠上洗脱下来，实现外泌体的分离富集；以及

外泌体表面蛋白的分析：构建一种基于多种核酸适配体及苝四酸二酰亚胺衍生物的信号开关策略，针对分离富集的外泌体，进行外泌体表面蛋白的表达量的分析；其中，

所述外泌体的分离富集包括以下步骤：

S1，提供一种微流控芯片，所述微流控芯片包括用于捕获外泌体的微室，两个进样口，以及一个出样口，所述微室中具有通过若干个水滴状微柱组成的阵列结构，所述微柱的高度为70μm，任意两相邻微柱间的距离为120μm，并采用含有BSA的封闭液对所述微流控芯片中的通道和微柱表面进行封闭处理；

S2，制备预偶联Tim4蛋白磁珠：将链霉亲和素磁珠与生物素修饰的鼠源Tim4蛋白在缓冲液中孵育制得预偶联Tim4蛋白磁珠；

S3，预偶联Tim4蛋白磁珠的预吸附：以0.25μL/min流速将步骤S2制备的预偶联Tim4蛋白磁珠通过两个进样口同时进样到步骤S1提供的微流控芯片中，并在所述微流控芯片底部放置磁铁，使所述预偶联Tim4蛋白磁珠均匀吸附在微柱区域；

S4，外泌体的分离富集：以0.25μL/min流速将含有外泌体的样品通过两个进样口同时进样到所述微流控芯片中，使外泌体与预偶联Tim4蛋白磁珠在微室中相结合形成Tim4磁珠-外泌体；

S5，外泌体的洗脱：以一定流速将清洗缓冲液进样到所述微流控芯片中，并移去所述磁铁，使所述Tim4磁珠-外泌体从所述微室中流出，然后采用洗脱液将外泌体从磁珠上洗脱下来；

所述外泌体表面蛋白的分析包括：将核酸适配体与纯化后的外泌体孵育10～30min，随后加入PTCDI复合物并孵育10～30min，测量496nm激发波长下的荧光，所述外泌体表面蛋白的表达量与加入外泌体前后的荧光强度差值线性相关，通过更换不同蛋白的核酸适配体，实现外泌体表面不同蛋白的表达量分析，通过该方法分析的所述外泌体膜表面蛋白为：CD63，PD-L1，Nucleolin，EpCAM，PTK-7，PSMA。