[发明专利]一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒及引物

说明书

本发明公开了一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒及引物。所述引物包括CIAV‑124‑F和CIAV‑124‑R，能针对CIAV的VP1基因中高保守性的基因片段能够特异性扩增的引物对，有效提高使用分子生物学检测CIAV的抗干扰能力。所述荧光定量PCR试剂盒包括前述的引物对，经试验证实其检测最低浓度为2.0×10^‑1copies/μL，相较于普通PCR的检测灵敏度提升达1000倍。且特异性良好，针对AIV‑5、AIV‑7、ILT、NDV、IBV、Fadv‑4等常见禽病不会出现明显的扩增曲线。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒及引物。

背景技术

鸡传染性贫血病(chicken infectious anemia，CIA)是由鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)引起鸡的再生障碍性贫血和全身性淋巴组织萎缩为主要特征的免疫抑制病。CIAV为圆环病毒科，圆环形病毒属的环状单股DNA病毒，无囊膜，呈二十面体对称结构，是目前已知基因组最小的病毒之一。该病毒自1979年首次被日本报道以来，此后陆续在美国、英国、澳大利亚、德国、丹麦等国家也出现了相关报道。1992年我国科学家首次分离到该病毒。近年来，随着相关人员的深入研究与数据积累，对CIAV已有一定的理解，但还需要更多的流行病学调查与病毒相关致病机理等方面的深入研究，才有助于尽早消灭该病对于养禽业的影响。

针对CIAV的检测技术目前主要分为以下6种。

病毒分离鉴定：病毒分离培养是CIAV鉴定中常用的方法之一。一般情况采集疑似病鸡的肝脏、脾脏、法氏囊等器官组织，碾磨后离心取上清液进行鸡胚、细胞或者动物接种实验进行病源分离。CIAV可在在马立克氏病肿瘤细胞系MDCC-MSBl、MDCC-JP2、MDCC-RPl细胞系正常生长，目前普遍使用MDCC-MSB1传代细胞或者SPF鸡胚进行病毒体外培养。需要花费较长时间才能完成分离和培养的完整流程。

电镜观察：直接电镜观察主要用于对粪便、组织培养物中病毒的定性和新分离毒株进行鉴定，也可通过纯化细胞培养液中的病毒粒子，再经过负染后进行电镜观察。但由于CIAV病毒粒子小，并且无论是感染易感动物还是接种于敏感细胞，获得的病毒效价都比较低，因此直接进行电镜观察很难见到病毒粒子。而免疫电镜(IEM)观察比直接电镜观察的敏感性更高，病毒是免疫复合物的聚集状态，对传统电镜观察粒子较小病毒分辨率不足的缺点进行大幅改进。分离、纯化、培养等步骤较为耗时，同时电镜设备昂贵，不利于该技术的推广使用。

血液学检测：对疑似病鸡采集血液，加入抗凝剂，随后取1mL抗凝血加入红细胞压积管中，以3000rpm离心30min。红细胞压积值低于27％且刨检病鸡出现骨髓黄染则可确诊。

病毒中和试验(Virus Neutralization Test,VN)：病毒中和试验可有效检测CIAV抗原与抗体效价，SPF鸡或CIAV适应细胞系进行试验均可。但其对标准品的准确性与相关试验人员的操作技术具有一定门槛，容易出现假阴性或假阳性，导致其在基层推广检测过程中结果的可靠性与稳定性容易出现问题，影响最终判断。

酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)：酶联免疫吸附试验是将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。实际生产中可从疑似或待测鸡群进行血液采集，分离血清后，使用商品化的CIA抗体检测试剂盒进行检测，虽然该方法易于进行大批量检测，且准确性和高效性较中核试验都有所提高，但无法判断待测鸡群处于发病初期、后期还是耐过。