[发明专利]一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法

说明书

本发明涉及一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法，将滚环扩增体系与血清混合后加入数字PCR芯片，通过优化血清稀释比例，生成粒径均一，单分散性良好的微液滴，血清标志物按照泊松分布分配进微液滴中，微液滴作为独立的反应室，在反应室中进行滚环扩增，可直接检测血清标志物的拷贝数，该技术有别于传统的滚环扩增检测方法，能够对待测物质进行绝对定量，因此提高了滚环扩增的灵敏度，并且可直接用于血清标志物的检测。

技术领域

本发明属于生化检测和分子诊断领域，具体涉及一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法。

背景技术

等温扩增反应温度单一，不受热循环的限制，因此在实际操作和设备要求上都相较简单，能够实现便携式的标志物快速检测。其中滚环扩增（rolling circleamplification，RCA）是发展最早，同时也是目前为止应用最广的等温扩增检测方法。滚环扩增的模板为环状DNA，该环状DNA与引物结合后，能在具有链置换特性的聚合酶，如phi29聚合酶（phi29 DNA Polymerase）、Phage T7以及Sequence等作用下扩增形成成千上万与其互补的序列。滚环扩增所需的设备简单、特异性高、通量大、反应温度温和，不会破坏生物分子的结构和功能，因此在全基因组检测、单核苷酸多态性分析、免疫分析及微阵列固相检测等方面都有着广阔的应用前景。然而滚环扩增的扩增效率有限，传统的线性滚环扩增在信号放大上存在局限，因此检测灵敏度不尽如人意，往往需要结合其他信号放大机制，例如荧光量子点、纳米电极复合材料等进行联合检测，这大大增加了前期材料准备时间和操作繁琐程度，降低了方法的稳定性和可重复性，不适用于临床。

发明内容

为解决传统的线性滚环扩增检测方法效率较低，无法对复杂体液环境中浓度较低的待测物质进行定量的问题，本发明提供了一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法，包括以下步骤：

（1）将滚环扩增体系与稀释后的血清加入数字PCR芯片，并在芯片对应的加样孔中加入数字PCR配套的液滴生成油，将芯片放置于数字PCR仪中生成微液滴；

（2）将微液滴作为独立的反应室等温孵育，进行滚轮扩增；

（3）通过芯片扫描仪对阳性反应单元进行计数，检测血清标志物的拷贝数。

本发明将滚环扩增体系与血清混合后加入数字PCR芯片，通过优化血清稀释比例，生成数量粒径均一，单分散性良好的微液滴，血清标志物按照泊松分布分配进微液滴中，微液滴作为独立的反应室，在反应室中进行滚环扩增，可直接检测血清标志物的拷贝数。

作为本发明的一种改进，步骤（1）中，所述血清中血清标志物按照泊松分布分配进微液滴中。

作为本发明的一种改进，步骤（1）中，所述血清的稀释倍数为50~1250倍。

作为本发明的一种改进，步骤（1）中，所述血清的稀释倍数为200~300倍。

作为本发明的一种改进，步骤（1）中，所述血清的稀释倍数为250倍。

作为本发明的一种改进，步骤（2）中，所述等温孵育的温度为25~37℃，等温孵育的时间为30~90min。

作为本发明的一种改进，所述等温孵育的温度为30℃，等温孵育的时间为45min。

本发明的有益效果为：

本发明将滚环扩增检测方法与数字微液滴技术结合，建立了一种数字滚环扩增检测方法，利用商业化的数字PCR仪生成成千上万个微液滴作为独立反应室，血清标志物按照泊松分布分配进微液滴中，在反应室中进行滚环扩增，扩增结束后通过商业化的芯片扫描仪对阳性反应单元进行计数。