[发明专利]有机微孔滤网滤纸条的制备及其在快速检测柑橘黄龙病中的应用

说明书

本发明公开了一种有机微孔滤网滤纸条，包括有机微孔滤网，有机微孔滤网一端为手持端、另一端为暴露端；手持端具有三明治结构，包括中间的有机微孔滤网以及附着在有机微孔滤网两面的滤纸；暴露端仅为有机微孔滤网。利用该有机微孔滤网滤纸条，于特定缓冲液中研磨和裂解获得的植物组织液中吸附样品DNA，通过洗涤液去除杂质，再将吸附的样品DNA洗脱到去离子水中，完成样品DNA捕获。据此，将其用于柑橘黄龙病的LAMP方法中，能够快速、简便、经济地在田间快速检测黄龙病菌，对于柑橘黄龙病防控具有重要意义。

技术领域

本发明属于柑橘黄龙病检测技术领域，尤其涉及一种有机微孔滤网滤纸条的制备及其在快速检测柑橘黄龙病中的应用，具体是利用有机微孔滤网滤纸条捕获样品DNA的方法以及据此检测柑橘黄龙病的LAMP方法。

背景技术

柑橘黄龙病发生严重，破坏性强，症状复杂，难以田间诊断，有效监测黄龙病的发生和分布是有效控制黄龙病的关键。因此，寻求更加准确、便捷、高效和低成本的检测技术对于防控此病具有非常重要的意义。目前在国际上主要采用PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)、串联重复序列的聚合酶链式置换反应(TR-PCDR)和液滴数字PCR等技术检测柑橘黄龙病。上述检测技术虽然灵敏度高，但是操作步骤复杂，需要昂贵的仪器设备，无法在田间应用，检测成本也较高。其中，在田间检测中最难实现的是DNA的快速提取。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种快速、简便、经济且易实现样品DNA提取的有机微孔滤网滤纸条的制备及其在快速检测柑橘黄龙病中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

有机微孔滤网滤纸条，包括有机微孔滤网，有机微孔滤网一端为手持端、另一端为暴露端；手持端具有三明治结构，包括中间的有机微孔滤网以及附着在有机微孔滤网两面的滤纸；暴露端仅为有机微孔滤网。

上述有机微孔滤网滤纸条的制备方法，将有机微孔滤网的两面与滤纸粘贴形成三明治结构，再裁剪成条状，一端暴露有机微孔滤网，另一端为为较有机微孔滤网更直挺的具有三明治结构的滤纸，两面滤纸中间夹着有机微孔滤网，便于手持。

上述有机微孔滤网滤纸条在捕获样品DNA中的应用。

有机微孔滤网滤纸条捕获样品DNA的方法，利用有机微孔滤网滤纸条，于研磨和裂解获得的植物组织液中吸附样品DNA，通过洗涤液去除杂质，再将吸附的样品DNA洗脱到去离子水中，完成样品DNA捕获；植物组织液由植物组织置于特定缓冲液中研磨和裂解而得；特定缓冲液包含20mM Tris-HCl(pH8.0)、25mM NaCl、2.5mM EDTA、0.05％SDS、2％DTT、3％PVP。

上述有机微孔滤网滤纸条在快速检测柑橘黄龙病中的应用。

快速检测柑橘黄龙病的LAMP方法，利用上述的有机微孔滤网滤纸条捕获样品DNA用于柑橘黄龙病的LAMP检测中。

快速检测柑橘黄龙病的LAMP方法，包括以下步骤：

(1)有机微孔滤网滤纸条法捕获核酸

撕取0.2g左右待测组织样品置于预装有裂解液的研磨袋中，用光滑硬物(如砝码等)将待测组织样品研磨破碎，然后用巴氏吸管吸取研磨得到的汁液于2mL离心管中，将有机微孔滤网滤纸条放入汁液中蘸3次，再置于预装有1mL洗涤液的2mL离心管中清洗3次，随后于含25μL LAMP反应液0.5mL离心管中蘸洗3次进行洗脱；

(2)LAMP反应

LAMP反应程序为：65℃，30min；85℃，7min。