[发明专利]β-半乳糖苷酶突变体及其在制备长链GOS中的应用

说明书

本发明公开了β‑半乳糖苷酶突变体及其在制备长链GOS中的应用，属于酶工程技术领域。本发明通过定点突变构建获得转苷/水解比提高的β‑半乳糖苷酶突变体R333M、N467S，在目前条件下，制备低聚半乳糖长链多糖的产率分别为41.60％、44.16％，较野生型分别提高了8.13％、11.14％，提升了低聚半乳糖的益生效果，具有较好的工业化应用潜力。

技术领域

本发明涉及β-半乳糖苷酶突变体及其在制备长链GOS中的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

随着社会的进步，现在人们的生活水平越来越高，人们越发注重身体保健，因此，社会上要求发展功能性食品的呼声越来越强烈。低聚半乳糖(GOS)便是功能性食品中一种具有天然属性的功能性低聚糖。GOS通常情况下是以D-葡萄糖为还原端残基，再连接2-8个半乳糖的长链多糖，某些情况下它的还原端也可为半乳糖。由于GOS在高温以及低pH下均表现出较高的稳定性，让它特别适合在商业食品中应用，并且为了模拟母乳中的人乳寡糖(HMOs)的作用，GOS是目前商业婴儿奶粉中首选的益生元添加剂。

GOS可以通过多种方式获得，目前市场上最主要的生产方式是由乳糖通过β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)制备获得。β-半乳糖苷酶，全称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，是一种对乳糖既可以发生水解也可以进行转糖苷的酶，在食品加工工业中有着广泛的应用。β-半乳糖苷酶与大多数糖苷水解酶(GHs)一样，通过双置换催化机制来将底物乳糖水解或形成GOS，该机制包含两个过程：糖基化与去糖基化，会形成一个中间体酶-糖基复合物。在去糖基化过程中，如果受体为水即为水解反应，生成半乳糖；如果受体为糖即为转苷反应，生成GOS，二者互为竞争关系。

有文献指出，在体外实验中，一些婴儿肠道菌群体外分离株会优先分解聚合度为3-8的GOS。这说明在一定聚合度范围内(2-8)，更高聚合度的GOS对肠道发酵更有耐受力，从而在更远的肠道位点发挥益生作用。目前，通过蛋白质工程手段对现有的酶进行改造从而获得满足需求的突变体是常用的手段之一。

发明内容

针对于目前存在的问题，本发明通过对来源于Bacillus circulans的β-半乳糖苷酶进行突变，从中筛选到了两株能够显著提升转苷反应比率的突变体。

本发明首先提供了β-半乳糖苷酶突变体，所述突变体是对氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的β-半乳糖苷酶的第333位或467位发生取代。

在一种实施方式中，将第333位的精氨酸取代成甲硫氨酸，或是将第467位的天冬酰胺取代成丝氨酸。

本发明还提供了一种编码上述β-半乳糖苷酶突变体的基因。

本发明还提供了携带所述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pPIC9K、pPIC3K、pET系列载体、Duet系列、pGEX系列。

本发明还提供了携带所述基因或者所述载体的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于细菌、真菌细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母或枯草芽孢杆菌。

本发明还提供了一种制备低聚半乳糖的方法，所述方法为将所述β-半乳糖苷酶突变体添加至含有乳糖的反应体系中进行反应，生成低聚半乳糖。

在一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶突变体的添加量不低于0.2U/g乳糖。

在一种实施方式中，底物乳糖的浓度为300～400g/L，优选为400g/L。

在一种实施方式中，所述反应体系中，pH为5.0±0.1。

在一种实施方式中，所述反应体系中，温度为45～55℃，优选为50℃。