[发明专利]一种同时表达PLAUR和GPLD1基因的质粒载体及其构建方法

权利要求书

1.一种同时表达PLAUR和GPLD1基因的质粒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、构建新克隆质粒载体

人工合成一段DNA，该DNA的序列中含有8个不同且按一定顺序分布的限制性内切酶的酶切位点，然后在位于该DNA序列中两端位置的限制性内切酶的酶切位点用对应的内切酶进行双酶切，得到具有上述8个酶切位点的DNA片段；选择仅在编码区具有1个上述DNA片段第一端位置的酶切位点和1个第二端位置的酶切位点的质粒载体并用对应的限制性内切酶进行双酶切处理，回收剩余的质粒载体片段，再通过相同的酶切位点将DNA片段克隆到酶切后的质粒载体片段中；

S2、基因片段扩增

根据PLAUR和GPLD1的编码区序列设计正反向引物，并在PLAUR的正反向引物序列的最前或最后对应引入第一个酶切位点和第二个酶切位点；在GPLD1的正反向引物序列的最前或最后对应引入第三个酶切位点和第四个酶切位点；扩增PLAUR和GPLD1基因得到带上述酶切位点的PLAUR和GPLD1基因片段；

同样地，对Puro基因和EGFP基因各设计两条扩增引物，在Puro的正反向引物序列的最前或最后对应引入第五个酶切位点和第六个酶切位点，进行扩增得到带第五酶切位点和第六酶切位点的Puro基因片段；在EGFP的正反向引物序列的最前或最后对应引入第七酶切位点和第八酶切位点，进行扩增得到带第七酶切位点和第八酶切位点的EGFP基因片段；

用DNA胶回收纯化试剂盒回收扩增得到的带各酶切位点的PLAUR、GPLD1、Puro和EGFP基因片段；

S3、重组质粒载体构建

将上述回收的带各酶切位点的PLAUR、GPLD1、Puro和EGFP基因片段和新克隆载体都用对应各酶切位点的限制性内切酶酶切处理，具有相同酶切位点的基因片段和新克隆质粒载体利用DNA连接酶进行连接，连接产物转化至感受态细胞中，培养转化成功的感受态细胞，小量提取质粒，得到含PLAUR、Puro、EGFP和GPLD1基因的重组质粒载体。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，8个限制性内切酶的酶切位点为NheⅠ、AgeⅠ、SbfⅠ、EcorⅠ、NsiⅠ、MluⅠ、AvrⅡ、BamhⅠ。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，选择的质粒载体上还具有四环素诱导表达系统。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：质粒载体选择pCW-Cas9-Blast作为载体质粒。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，PLAUR的扩增引物序列如下：

F：tataGCTAGCaccatgggtcacccg；

R：taACCGGTggtccagaggagagtg。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，GPLD1的扩增引物序列如下：

F：tataCCTGCAGGaccatgtctgctttc；

R：ttGAATTCatctgagccaaggctatagacg。

7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，Puro的扩增引物序列如下：

F：ttACGCGTggcaccgggcttg；

R：ttGAATTCaccatgaccgagtacaag。

8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，EGFP的扩增引物序列如下：

F：ttCCTAGGgtgagcaagggcga；

R：ttGGATCCttacttgtacagctcgtccat。

9.根据权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到的质粒载体。