[发明专利]大肠杆菌膜蛋白ZraS突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法与应用

说明书

本发明提供大肠杆菌双组分调控系统膜蛋白ZraS突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法与应用。所述突变体包括S154T、A214S、Q313R、T415A中的一种或几种。这些突变体的制备方法包括：构建SP‑ZraS噬菌体；采用噬菌体辅助连续定向进化方法(PACE)通过正筛与负筛交替进化SP‑ZraS噬菌体对铅离子的底物特异性，获得进化样品；对进化样品进行氨基酸测序分析，获得突变位点信息；根据突变位点信息构建所述膜蛋白ZraS突变体的表达载体，记作pZraS，并表达获得所述膜蛋白ZraS突变体。该突变体对金属铅离子的响应灵敏度较比野生型系统具有显著提升，对铅的调控范围增大，检测限低至1μM；同时当离子浓度范围在0～10μM时，可实现对重金属铅离子的特异、灵敏检测。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及大肠杆菌膜蛋白ZraS突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法与应用。

背景技术

铅是一种在自然界广泛分布的环境重金属污染物，土壤、空气和水源中都不同程度地含有一定量的铅，这些铅会通过空气、水源和土壤进入我们的食物中。食物中的铅主要是由环境污染带入食品原料，从而通过膳食摄入体内。所以，食物中铅超标，多是由于生产企业对原料把关不严格，使用了铅含量超标的原料，当然也不排除从生产设备迁移入食品的可能。铅在体内半衰期较长，故可长期在体内蓄积。若体内铅含量超标，吸收到血液中的铅会对生物体内许多器官组织都具有不同程度的损害作用，尤其对造血系统、神经系统和肾脏的损害尤为明显。作为一种对人类健康具有严重威胁的一种重金属，食品中铅的检测尤为重要。

随着环境污染的严峻及人们对生活质量要求的提高，对食品来源及其安全性越来越重视，尤其需要对其中含有的重金属、抗生素等有害成分进行严格把控。目前常用的检测方法，一般是将样品前处理技术和色谱、质谱分离分析技术集成；此外还有化学定性检测、酶抑制、基于抗原抗体识别的ELISA酶联反应、表面等离子共振、光纤信号转导放大等技术，在国内外的农产品与食品安全检测中逐渐得到应用。然而，已有检测方法未尽如人意，存在应用面不广、实验操作较复杂、大规模检测成本较高等局限。

在原核细胞中，作为外部刺激与细胞应激偶联的重要机制，双组分调控系统一般由膜上的组氨酸激酶受体(Sensor histidine kinase,HK)与胞内的应答调控蛋白(Response regulator,RR)组成，HK负责感应外部信号，RR负责调控靶基因的表达。HK被外部刺激激活后将自身的一个组氨酸磷酸化，然后将磷酸基团传递到应答调控蛋白RR上的一个天冬氨酸上并激活，激活后的RR调控靶基因的表达；这是一套天然的信号转导系统，快速地将胞外刺激信号转导到胞内的基因表达应答。以双组分调控系统为核心，以微生物细胞作为传感器检测主体，将微生物细胞与理化检测器结合，利用微生物细胞对于重金属灵敏感应，输出颜色的、荧光的或冷光的信号，并采用分光光度计、酶标仪等器材读取检测结果。双组分调控系统作为信号转导环节具有两大优越性：①微生物活细胞自发提供了信号转导所需的各调控蛋白元件，无需额外购买试剂，成本低廉；②微生物活细胞通过细胞膜将胞外的环境波动与胞内的报告基因表达有效隔离，因此系统的稳健性将显著优于酶促反应，对被测样品前处理或纯度的要求大大降低。

大肠杆菌双组分调控系统ZraS-ZraR可识别和感应胞外金属铅和锌离子，当胞外存在铅离子时，膜蛋白ZraS识别离子信号，随即激活调控蛋白ZraR使其磷酸化，磷酸化的ZraR调控蛋白与ZraP启动子上游的识别位点结合，诱导靶基因ZraP的表达。利用该系统对铅离子或锌离子检测具有高效性及特异性，是理想的微生物检测器。鉴于铅对人体的危害性，检测农产品中铅的含量具有更大的应用价值及意义。但在实际应用过程中，待测样品往往成分复杂，且可能两种离子会同时存在，而该系统无法将铅离子和锌离子特异区分。另一方面，据文献报道，应用大肠杆菌双组分调控系统ZraS-ZraR对铅的检测范围为 0.3～1.0mM；然而，据国家铅限量标准，食品中铅的含量普遍低于 1.0mg/kg(0.0048mM)，使用野生型系统难以实现检测目标。

发明内容