[发明专利]一种利用RNA恒温扩增CRISPR检测的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种利用RNA恒温扩增CRISPR检测的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒。试剂盒主要包括：1)耐高温的扩增酶，2)TB扩增缓冲液；3)检测酶；4)TB检测缓冲液；5)矿物油；6)C‑tube(能在一管中将上下液体试剂分开的反应管)。本试剂盒检测痰液等样本中的结核分枝杆菌(TB)16S rRNA靶标，具有单管，一步，快速，特异性高，灵敏度高，扩增产物为RNA不易发生污染等特点。本试剂盒灵敏度可以高达1个菌/mL，或者2.5copies/每反应的样本。本发明能为临床上诊断结核分枝杆菌的感染提供分子水平的判断依据和帮助。

技术领域：

本发明属于结核分枝杆菌核酸的分子检测技术领域，具体涉及靶标RNA的等温扩增和CRISPR/Cas蛋白检测的分子检测技术及其相应的检测试剂盒。本发明实现了在单管中一步法对结核分枝杆菌16S rRNA的恒温扩增和CRISPR/Cas13a检测。

技术背景：

世界卫生组织发布的2020年全球结核病报告，据估算2019年全球新发结核病患者约1000万，全球因结核死亡患者约141万。其中，中国新发患者数约83.3万，约占全球8.4％，居全球第三位，仅次于印度26％，印度尼西亚8.5％。因此我国的结核病的诊断，防治形势依然十分严峻。

结核病(TB)是一种由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染引起传染性疾病，是单一感染原的主要死因，也是全球十大死因之一。结核病最主要是发生肺部感染，即肺结核，但也可累及其他部位，即肺外结核病。结核分枝杆菌属于放射菌目、分枝杆菌科、分支杆菌属，是一种革兰氏阳性的专性需氧细菌，是结构细长略带弯曲的棒状杆菌，大小1～4X 0.4μm，细胞壁一般含有大量的脂质，在干燥的环境下可存活长达数天到几个月。结核分枝杆菌的最适生长温度为37℃，最适pH值为6.8～7.2，在一般的培养基中每分裂1代需时18～24小时，生长较为缓慢。结核分枝杆菌一般包括：人结核分枝杆菌，牛结核分枝杆菌，田鼠结核分枝杆菌，非洲分枝杆菌等，坎纳分枝杆菌等，其中以人结核分枝杆菌感染人最为常见，牛结核分枝杆菌也可以感染人，其他结核分支杆菌感染人的情况比较少见。早期的肺结核症状一般较轻且不明显，这会使得许多活动的、有传染性的结核患者在较长的一段时间内不会被发现，容易在人群中发生传播。结核主要通过呼吸道飞沫和空气进行传播，结核感染患者可以通过咳嗽，打喷嚏或者正常说话等，向周围环境中释放含有结核分枝杆菌的飞沫，来感染周围的人群。大多数人在感染接触到结核分枝杆菌后，免疫系统在2-10周内会抑制结核杆菌的增值，从这一阶段开始有些感染者会发展成具有传染性的活动性肺结核，而大多数人并不会发展成活动性的肺结核。

目前对结核病的诊断主要是通过临床特征，影像学表现和实验室诊断相结合方式进行，实验室诊断主要包括，1)细菌学的检查方法：如涂片抗酸染色检查和结核菌培；2)免疫学方法检查：结核菌素皮肤试验和基于抗原抗体技术的ELISA和T-SPOT试验；核酸分子学检查：主要包括核酸的荧光定量PCR和等温扩增等。

(一)细菌学检查方法：

1.涂片抗酸染色检查是结核分枝杆菌最常用的检查手段，临床常通常根据镜检视野下阳性菌的数量作为诊断结果的等级划分，一般的报告标准如下：

抗酸染色阴性(-)：300连续视野(1000倍)未找到分枝杆菌；

抗酸染色阳性(报告抗酸杆菌菌数)：1～8个抗酸杆菌/300视野；

抗酸染色阳性(+)：3～9个抗酸杆菌/100视野，连续观察300视野；

抗酸染色阳性(++)：1～9个抗酸杆菌/10视野，连续观察100视野；

抗酸染色阳性(+++)：1～9个抗酸杆菌/每视野，连续观察10视野；

抗酸染色阳性(++++)：10个以上抗酸杆菌/每视野。