[发明专利]一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物及其应用

说明书

本发明提供了一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物及其应用。所述数字PCR引物探针组合物包括分别检测MCR‑1基因、MCR‑2基因、MCR‑3基因、MCR‑4基因和MCR‑5基因的引物对和探针。所述数字PCR引物探针组合物具备高灵敏度和特异性，能够有效应用于数字PCR中，对MCR家族基因进行快速、灵敏、准确检测，利用所述数字PCR引物探针组合物制备的数字PCR试剂盒可以对样本是否含有MCR家族基因以及具体的基因种类进行快速准确的检测，并且可以对基因的拷贝数进行检测，实现了基因的绝对定量；无需建立标准曲线，实验的重复性、平行性及灵敏性均较好。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，涉及一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物及其应用。

背景技术

兽用抗菌药物在防治动物疾病、提高养殖效益、保障畜禽水产品有效供给中发挥了重要作用，然而目前兽用抗菌药物市场秩序不规范、养殖环节使用不合理、科学安全用药意识不强等问题较为突出，动物源细菌耐药性风险评估和防控体系薄弱，致使多重耐药菌甚至超级耐药菌出现，细菌耐药形势严峻。细菌耐药率上升，致使兽用抗菌药物疗效降低，迫使养殖用药增加，从而造成兽用抗菌药物毒副作用加剧、兽药残留超标风险提高，威胁了畜禽水产品食品安全和公共卫生安全。开展细菌抗生素耐药性(AntimicrobialResistance，AMR)检测技术研究，综合治理兽用抗菌药物，遏制细菌耐药性，是推动养殖业供给侧结构性改革，保障畜禽水产品质量安全的关键环节。

多粘菌素(polymyxin/colistin)被认为是防治产β-内酰胺酶革兰阴性菌(如鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌以及肺炎克雷伯菌等)感染的“最后一道防线”，常被用作动物饲料的添加剂。但是目前已有多种细菌产生了对多粘菌素的耐药性，并且这种耐药性还在肉用动物和人类中同时存在，2015年中国科学家首次报道了从动物源大肠埃希菌中分离到质粒介导的多粘菌素抗性基因MCR-1，随后，陆续有多种多粘菌素抗性基因(MCR基因)被报道(包括MCR-2、MCR-3、MCR-4、MCR-5、MCR-6、MCR-7、MCR-8、MCR-9以及MCR-10等)。

针对细菌多粘菌素耐药性检测，目前仍主要依赖于表型检测(细菌敏感性实验)或常规PCR检测等方法。

CN108504723A公开了一种用于检测细菌MCR-1基因的引物组合物及应用，包括以下引物：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB，该引物组合物用于检测大肠杆菌的MCR-1耐药基因，可用于检测样本中是否含有细菌MCR-1耐药基因，有利于临床对细菌MCR-1耐药基因的检测监控，但其检测灵敏度及精密度较低，且检测需建立工作曲线，分析结果过程复杂，难度高。

CN108384851A公开了一种检测多粘菌素耐药基因的多重PCR引物，由五个引物对组成，通过在MCR-1、MCR-2、MCR-3、MCR-4、MCR-5的基因序列基础上进行引物设计，利用不同PCR产物的大小对相应的耐药基因加以区分，并对反应体系及条件加以优化，能够对多粘菌素耐药基因进行有效检测，但其通过观察凝胶电泳条带进行结果鉴定，耗时长，且准确度、特异性及灵敏度均难以满足目前进行快速、灵敏及准确检测的需求。

综上所述，建立一种针对MCR基因的快速灵敏且准确的检测方法，对于AMR检测领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物及其应用，所述引物探针组合物具备高特异性和灵敏度，利用所述引物探针组合物配合数字PCR检测方法，并控制引物探针的浓度以及退火温度，实现了MCR家族基因的快速、灵敏、准确检测，可应用于多粘菌素AMR的监测和防控。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测多粘菌素耐药基因的数字PCR引物探针组合物，所述数字PCR引物探针组合物包括分别检测MCR-1基因、MCR-2基因、MCR-3基因、MCR-4基因和MCR-5基因的引物对和探针。