[发明专利]从骆驼乳粉中提取纯化DNA的方法，及应用所述方法的骆驼乳粉的检测方法

权利要求书

1.从骆驼乳粉中提取纯化DNA的方法，其特征在于通过柱式深加工产品基因组DNA抽提试剂盒从骆驼乳粉中提取纯化DNA，所述方法包括以下步骤：

(1)称取600-700mg骆驼乳粉样品于2ml离心管中，加入1ml裂解液GMO Buffer和20μlProteinase K蛋白酶，震荡混匀，在65℃水浴锅裂解1h；

(2)水浴结束后，离心吸取上清液，12000rpm下离心3min，转移上清液至新的2ml离心管中，向上清液加入400μl氯仿，充分混匀后离心吸取上清液，在12000rpm下离心5min，再转移上清液至新的2ml离心管中，再次加入400μl氯仿，充分混匀再次离心取上清液，在12000rpm下离心5min，转移上清液至新的2ml离心管中；

(3)向步骤(2)得到的产物中加入等体积的裂解液GMP Buffer，充分混匀后加入300μl异丙醇，充分混匀后室温静置30min；

(4)将步骤(3)得到的产物取700-800μl转移至吸附柱中，室温放置2min后离心，在12000rpm下离心30s，再将滤液倒入吸附柱后再离心弃滤液，在12000rpm下离心30s，将吸附柱放回收集管中；

(5)向吸附柱中加入500μl洗涤液Wash Solution后离心弃滤液，在12000rpm下离心30s，将吸附柱放回收集管中；

(6)重复操作步骤(5)；

(7)将吸附柱放回收集管中，空管离心弃滤液，离心速度为12000rpm，离心时间为2min；

(8)取出吸附柱，放入一个新的2ml离心管中，打开盖子在56℃干燥箱中干燥10min；

(9)在吸附膜中央加入50μl洗脱液TE Buffer(pH8.0)洗脱核酸，室温静置3-5min，使核酸充分的从吸附膜上剥离，进行离心，离心速度为12000rpm，离心时间为2min，得到含有纯化DNA的核酸溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于各步骤的离心操作是在常温下进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)的异丙醇保存于-20℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)的洗涤液Wash Solution中含有无水乙醇，无水乙醇在洗涤液Wash Solution中的体积比为80％。

5.一种骆驼乳粉的检测方法，其特征在于通过根据权利要求1-4中任一项权利要求所述的方法从乳粉中获得含有纯化DNA的核酸溶液，然后采用Nanodrop微量分光光度计测定核酸溶液的浓度和纯度，采用PCR扩增方法对核酸溶液的总基因组进行物种鉴定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于PCR扩增方法中，引物序列如下：

luotuo-F:5'-CATTATCACGGCTCTAGTGGC-3'

luotuo-R:5'-CTGGTGAGAATAATACGAGGATAAG-3'。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于PCR扩增方法中，扩增体系包括：模板基因组DNA 1μl，10μM所述上引物1μl，10μM所述下引物1μl，10mM Dntp(mix)1μl，10×Taq Buffer(with MgCl₂)2.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，补加无菌无酶水至PCR扩增体系总体积25μl；

所述PCR扩增程序为：

95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，每个循环降温0.5℃，72℃延伸30s，10个循环；95℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃修复延106min，4℃保温。

8.用于检测骆驼乳粉的特异性引物，其特征在于所述引物序列如下：

luotuo-F:5'-CATTATCACGGCTCTAGTGGC-3'

luotuo-R:5'-CTGGTGAGAATAATACGAGGATAAG-3'。

9.根据权利要求8所述的特异性引物，其特征在于通过根据权利要求1-4中任一项权利要求所述的方法从乳粉中获得含有纯化DNA的核酸溶液，然后采用Nanodrop微量分光光度计测定核酸溶液的浓度和纯度，采用PCR扩增方法对核酸溶液的总基因组进行物种鉴定。