[发明专利]特异性抑制KSR1基因表达的shRNA及其应用

说明书

本发明提供了一种特异性抑制KSR1基因表达的shRNA及应用，属于结肠癌基因沉默治疗技术领域；本发明基于KSR1基因的mRNA序列，设计筛选出2条shRNA并基于shRNA构建慢病毒载体pLKO.1‑TRC‑shKSR1(简称为shKSR1)，通过实验发现shRNA可以显著降低KSR1基因在结肠癌细胞中的表达；所述shRNA在未来结肠癌的靶向基因药物研发中具有巨大的潜在价值。

技术领域

本发明属于结肠癌基因沉默治疗技术领域，具体涉及一种特异性抑制KSR1基因表达的shRNA及其应用。

背景技术

RNA干扰技术(RNAinterference, RNAi)是物种在进化上的一种高度保守的基因防御机制，即一种依赖于双链RNA特异性短序列实现转录后的基因沉默的技术。目前实验室常用的RNAi技术主要有siRNA寡核苷酸载体与shRNA慢病毒质粒表达载体。siRNA是短的双链RNA，大小在19-29 nt左右，3´端有两个游离的碱基，可激活RNA的干扰，通过与目标mRNA互补序列结合，特异性地实现mRNA降解。但是siRNA在细胞中的表达是瞬时的，发挥作用的时间比较短。相对于siRNA，短发夹核糖核酸(Short Hairpin RNA, shRNA)可以通过病毒介导的转染保持稳定，能够减少脱靶效应。shRNA包括两个短的反向重复序列，中间由茎环结构进行分割，组成一个类似发夹的结构。shRNA首先被插入到慢病毒载体上形成重组慢病毒质粒，慢病毒质粒与其他辅助质粒借助于293FT细胞形成慢病毒，最终用慢病毒转染细胞发挥shRNA的沉默作用。

KSR1又称Ras 分子支架激酶抑制剂。在Raf-MEK-ERK激酶级联反应中，起到分子支架作用，促进Raf家族成员的磷酸化和下游MAP激酶的激活；同时参与调节多种细胞机制以促进细胞增殖和存活，包括参与代谢调节、DNA损伤后细胞周期的重新启动。

结直肠癌早期症状不明显，其发病率和死亡率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。虽然中国属于低发地区，但其发生率在不少地区处于呈现上升趋势。全球统计显示，结直肠癌患者分布广泛，经济发达地区尤其严重。由于经济文明的发展导致饮食，水质等一系列变化可能是结肠癌发病率逐年提升的关键。

目前医学上，一般早期结肠癌推荐外科手术治疗，辅以放化疗。而对于中晚期，特别是发展严重转移后，一般利用靶向药物进行治疗。自从靶向药物获批以用于结直肠癌治疗以后，晚期的结直肠癌患者生存期具有显著提升。但目前没有针对于结肠癌最重要的两个突变——RAS和WNT信号通路的靶向药物。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种特异性抑制KSR1基因表达的shRNA及应用。本发明基于KSR1基因的mRNA序列，设计筛选出2条shRNA并基于shRNA构建慢病毒载体pLKO.1-TRC-shKSR1(简称为shKSR1)，通过实验发现shRNA可以显著降低KSR1基因在结肠癌细胞中的表达；所述shRNA在未来结肠癌的靶向基因药物研发中具有巨大的潜在价值。

本发明中首先提供了特异性抑制KSR1基因表达的shRNA序列，所述shRNA为shKSR1-1 或shKSR1-2；

其中，shKSR1-1 的序列为：

F:CCGACTTCGAGAAGTTCTTTCTCGAGCTCGAGAAAGAACTTCTCGAAGTCAAAAA(SEQ.ID.NO.1)；

R:CAAAAACTGAAGCTCTTCAAGAAAGAGCTCGAGCTCTTTCTTGAAGAGCTTCAGCCGG(SEQ.ID.NO.2)；

所述shKSR1-2序列为：

F:CCGGGGCATCGTACACAAAGATCTCCTCGAGGAGATCTTTGTGTACGATGCCTTTTTG(SEQ.ID.NO.3)；

R:GGCCGACTTCGAGAAGTTCTTTCTCGAGCTCGAGAAAGAACTTCTCGAAGTCAAAAA(SEQ.ID.NO.4)。