[发明专利]三维DNA步行器及其在肿瘤外泌体检测中的应用

说明书

本发明提供了一种三维DNA步行器及其在肿瘤外泌体检测中的应用，三维DNA步行器包括裂开型探针a、裂开型探针b、发夹H1和发夹H2；裂开型探针a由裂开型Aptamer序列Apt‑a和裂开型触发序列Ta连接而成，裂开型探针b由裂开型Aptamer序列Apt‑b和裂开型触发序列Tb连接而成。本发明利用靶标外泌体作为三维轨道载体，通过胆固醇‑磷脂双分子层相互作用即可快速、方便地合成催化发夹组装的三维轨道，极大地简化实验操作过程。受益于Aptamer特异性识别性能和基于裂开型触发链策略的低背景优势，三维DNA步行器可用于检测肿瘤外泌体，在复杂体系、甚至临床血浆中也能实现靶标的直接检测。

技术领域

本发明属于生物化学领域中的检测方法，尤其涉及一种三维DNA步行器及其在肿瘤外泌体检测中的应用。

背景技术

糖基化作为生物体内最丰富的蛋白质翻译后修饰(PMT)形式之一，与肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关，因此有助于更好地了解外泌体在细胞间通讯中的信号传导特性。肿瘤来源外泌体(Exos)是纳米级细胞外囊泡，通过选择性包裹蛋白、核酸和脂质等生物活性分子，并将其转移到受体细胞，而在生理和病理过程中发挥重要作用。因此，监测外泌体表面糖蛋白的表达水平对生物学功能研究具有重要意义。然而，在肿瘤早期阶段，肿瘤外泌体的丰度很低，其信号通常被大量存在的异质性外泌体所掩盖。此外，外泌体糖蛋白在调节生物学功能方面的研究仍然很少。因此，通过分析外泌体糖蛋白来实现生物体液中低浓度肿瘤外泌体的高灵敏和高准确分析是非常可取，但具有极大挑战性。

三维DNA步行器作为最突出的分子机器之一，由于其大的比表面积和高的装载量而表现出更强的信号放大能力，因此在生物传感器的构建中显示出巨大的应用潜力。目前，已发展的以三维纳米材料为轨道载体的DNA步行器主要是基于金纳米颗粒、磁珠等。尽管这些传统DNA步行器的检测灵敏度得到了很大提升，但轨道组件的低效组装和通过化学键锚定的DNA行走链，会限制DNA步行器的自由行走，导致其行走效率降低。同时该轨道制备过程存在操作复杂、合成产率低、合成成本高等问题，这些都会极大地限制其临床诊断应用。因此，发展一种轨道制备简单且行走效率高的DNA步行器用于肿瘤外泌体的高灵敏、高特异性和高准确性检测有望为肿瘤早期诊断提供技术方法与重要信息。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种制备简单且行走效率高的轨道自助型三维DNA步行器及其在肿瘤外泌体检测中的应用，以解决传统DNA步行器存在的轨道制作复杂、合成产率低、合成成本高、耗时等问题。

为了实现上述目的，本发明提供了一种三维DNA步行器，所述三维DNA步行器包括裂开型探针a、裂开型探针b、发夹H1和发夹H2；所述裂开型探针a由裂开型Aptamer序列Apt-a和裂开型触发序列Ta连接而成，所述裂开型探针b由Apt-b和Tb连接而成；

所述裂开型Aptamer序列Apt-a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述裂开型Aptamer序列Apt-b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述裂开型触发序列Ta的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述裂开型触发序列Tb的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述发夹H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述发夹H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

上述的三维DNA步行器，进一步的，所述裂开型Aptamer序列Apt-a、裂开型触发序列Ta通过链接片段linker连接形成，

所述链接片段linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.5。

上述的三维DNA步行器，进一步的，荧光供体染料分子Cy3修饰在发夹H1的中间骨架上；荧光受体染料分子Cy5修饰在发夹H2的中间骨架上。