[发明专利]间充质干细胞的细胞培养方法

说明书

本公开涉及在无胎牛血清细胞培养期间促进细胞增殖的方法、细胞培养基和组合物。

本申请是申请日为2016年3月4日、发明名称为“间充质干细胞的细胞培养方法”的中国发明专利申请No.201680025469.8的分案申请。

技术领域

本公开涉及在无胎牛血清(FBS)细胞培养期间促进干细胞增殖的方法、细胞培养基和组合物。

背景

已经提出多能间充质干细胞(MSC)作为治疗应用的令人瞩目的候选物，因为它们具有高增殖和分化潜能以及免疫调节特性和其它有益特性(Caplan AI(2007)J.CellPhysiol.,213,341-347；Prockop DJ(2007)Clin Pharmacol Ther.,82,241-243)。稀疏的间充质干细胞(MSC)群体的离体繁殖通常是产生适合治疗应用的数量所必需的。

用于分离和扩增MSC的常规培养基由补充有胎牛血清的确定成分基础培养基(例如杜氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)或α改良型最低必需培养基(α-MEM))组成，因为胎牛血清具有高含量的刺激生长因子。虽然通常报道这些培养基支持MSC的多次传代增殖，但由于与胎牛血清相关的潜在风险，它们已经引起了人们的担心(DimarakisLevicar(2006)Stem Cells.,24,1407–1408；MannelloTonti(2007)Stem Cells.,25,1603–1609)。特别是胎牛血清可能含有有害污染物，如朊病毒、病毒和人畜共患病病原体，并且可以引发免疫反应。此外，胎牛血清的性质不稳定，批次间的差异较大，可能会导致培养基的生长支持性质不一致，从而导致难以实现细胞生产过程的标准化。

已经研究人源补充物如人血清和血小板裂解物作为胎牛血清的替代物。人血清由于缺乏可用性和不一致的生长促进潜力而通常不被视为合适的替代物。人血小板源性补充物如血小板裂解物(hPL)和富血小板血浆最近被提出作为优选的替代物(Doucet等人(2005)J Cell Physiol.,205,228–236；Muller等人(2006)，Cytotherapy.,8,437–444；Capelli等人(2007)Bone Marrow Transplant.,40,785–91；Lange等人(2007)J CellPhysiol.,213,18–26；Reinisch等人(2007)Regen Med.,2,371–82)。虽然这些研究证明了汇集的人血小板衍生物具有相当明显的生长促进性质，但它们对MSC生长的影响是不一致的(Bieback等人(2008)Transfus Med Hemother.,35,286–294)。此外，这些hPL制剂的高成本对于商业细胞培养可能是难以接受的。

因此，仍然存在对支持在无胎牛血清细胞培养中分离和快速扩增MSC的成本有效的方法的未满足的需要。

概述

本发明人已经发现，在无胎牛血清培养条件下进行MSC增殖需要血小板源性生长因子(PDGF)。本发明人还发现成纤维细胞生长因子2(FGF2)和PDGF协同促进无胎牛血清培养条件下的MSC增殖。令人惊讶的是，当FGF2以非常低的水平存在时，这种协同作用得以保持。因此，本发明人已经发现，他们能够使用生长因子的特定组合在无胎牛血清培养条件下增加体外干细胞增殖。这些研究结果表明，本公开的方法、培养基和组合物可以提供合适的有成本效益的血清替代物，该替代物也可以适于提高干细胞培养的效率。

因此，在一个实例中，本公开涉及一种促进体外干细胞增殖的方法，所述方法包括在包含PDGF和FGF2的无胎牛血清细胞培养基中培养间充质谱系干细胞群，其中FGF2的水平小于约6ng/ml。在另一个实例中，本公开涉及一种促进体外间充质谱系前体细胞增殖的方法。在另一个实例中，本公开涉及一种促进体外间充质干细胞增殖的方法。