[发明专利]靶向超敏广谱溶瘤病毒制备及应用

权利要求书

1.一种包含重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的重组病毒，其特征在于，所述重组病毒由重组新城疫病毒NDV-GHF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯救获得；所述重组新城疫病毒NDV-GHF质粒是将新城疫病毒NDV与α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因进行重组后的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒；所述辅助质粒选自辅助质粒N、辅助质粒P和辅助质粒L。

2.如权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，所述新城疫病毒NDV的基因序列见GenBank FJ766530.1；所述HPSE基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α-1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示。

3.如权利要求1或2所述的重组病毒在制备融化肿瘤物理屏障的药物中的应用。

4.重组新城疫病毒NDV-GHF质粒，其特征在于，在新城疫病毒NDV中重组包含α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒；所述重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的载体是TVT/071204，所述α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因插入的位点为Age I、SanD I。

5.如权利要求4所述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒，其特征在于，所述HPSE基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α-1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示。

6.如权利要求4或5所述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒在构建包含重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的重组新城疫病毒中的应用。

7.一种如权利要求1或2所述的重组病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一、构建所述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒；

步骤二、提取测序正确的所述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒；

步骤三、BSR细胞复苏、换液、传代和铺板；

步骤四、利用痘苗病毒感染BSR细胞，然后用所述步骤二中提取的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒对BSR细胞进行转染；

步骤五、取所述步骤四转染后的细胞上清接种到鸡胚中，拯救病毒；

步骤六、从所述步骤五中的鸡胚中收毒，检测血凝效价，确认获得重组病毒。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤一中，所述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的构建方法包括以下步骤：

（1）线性化超敏NDV载体：用Age I和SanD I双酶切超敏NDV骨架载体TVT/071204，回收载体大片段；

（2）扩增目的基因片段；所述目的基因的序列如SEQ ID NO:1~3所示；

（3）将所述步骤（1）回收的载体片段与所述步骤（2）的目的基因进行同源重组，连接产物转化至TransStbl3感受态细胞，抽提质粒，通过PCR和Age I、SanD I双酶切鉴定获得阳性重组NDV质粒，命名为重组新城疫病毒NDV-GHF质粒。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述扩增中引物的序列如下所示：

PF：

CCCAAGGTCCAACTCTGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAAGTGCCACCGACCCCCGGGTCCGCCCG

PR：AGGATTGCCGCTTGGGTTTAAACTCATTTGATTTCCACTTTGGTCC。

10.一种静脉注射制剂，其特征在于，所述静脉注射制剂包括如权利要求1或2所述的重组病毒。

11.如权利要求1或2所述的重组病毒、或如权利要求10所述的静脉注射制剂在制备新城疫病毒疫苗中的应用。