[发明专利]一种基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法

权利要求书

1.一种基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(一)PpDAM5基因相对表达量的检测：

(1)RNA提取：取已知需冷量的桃品种的落叶时期的未落叶片，提取RNA；

(2)反转录cDNA合成：将提取得的RNA反转录合成第一链cDNA；

(3)qRT-PCR检测：以合成的cDNA为模板，分别以内参基因Actin基因和目的基因PpDAM5基因的引物对作为引物进行qRT-PCR扩增，绘制扩增溶解曲线，获得内参基因Actin基因和目的基因PpDAM5基因的表达量，计算获得目的基因PpDAM5基因的相对表达量；

(二)PpDAM5基因相对表达量与需冷量的等级划分：

将步骤(一)中获得的已知需冷量的桃品种叶片的PpDAM5基因相对表达量与其需冷量建立需冷等级划分模型，如下：

(三)待测桃品种的快速测算：

将需冷量待测的桃树新品种进行步骤(一)PpDAM5基因相对表达量的检测，然后根据步骤(二)建立的需冷等级划分模型进行匹配，初步快速测算待测桃品种的需冷量。

2.根据权利要求1所述的基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述目的基因PpDAM5基因的上、下游引物分别为PpDAM5-F和PpDAM5-R；PpDAM5-F和PpDAM5-R引物序列分别为：

PpDAM5-F：5’-ATCTCCACCACCTGCAACAGT-3’；

PpDAM5-R：5’-CTTCTTAACGCCCCAGTTTGAG-3’。

3.根据权利要求1所述的基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述内参基因Actin基因的上、下游引物分别为Actin-F和Actin-R；Actin-F和Actin-R引物序列分别为：

Actin-F：5’-CAGATCATGTTTGAGACCTTCAATGT-3’；

Actin-R：5’-CATCACCAGAGTCCAGCACAAT-3’。

4.根据权利要求1所述的基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述qRT-PCR扩增的扩增体系以20μL计，包括以下组分：RNase-FreeddH₂O 8μL，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL，cDNA模板1μL，上、下游引物各0.5μL；

5.根据权利要求4所述的基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述qRT-PCR扩增的扩增条件包括以下步骤：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸20s；所述预变性-变性-退火-延伸进行40个循环。

6.根据权利要求1所述的基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反转录合成cDNA的反应体系以8μL计，包括以下组分：RNase-FreeddH₂O 5μL，4×gDNA wiper Mix 2μL，RNA模板1μL；

7.根据权利要求6所述的基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反转录合成cDNA的反应条件为：50℃15min，85℃5s。

8.根据权利要求1所述的基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述RNA的提取方法为采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法提取RNA。

9.根据权利要求1所述的基于qRT-PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述已知需冷量的桃品种为秋蜜桃1号、鹰嘴蜜桃、霞脆、银河、金霞油蟠、紫金红2号、金霞早油蟠、霞晖5号和霞晖8号中的任一种。